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昆虫病原细菌Photorhabdus胞内晶体蛋白生物学功能的研究

游娟  
【摘要】:昆虫病原Photorhabdus属细菌为昆虫病原异小杆属Heterorhabditis线虫的共生细菌,在这类线虫的产业化培养中发挥重要作用。初生型共生细菌产生两种型态的胞内晶体蛋白CipA及CipB。由于此类晶体蛋白不能为细菌自身所利用,且氨基酸组成与线虫的营养需求相似,它们的大量产生被认为与细菌的共生性有关。鉴于共生系统的复杂性及其它代谢物质的干扰,胞内晶体蛋白的生物学功能一直未能确定。共生细菌胞内晶体蛋白的研究,不仅有利于线虫—细菌共生机制的探索,而且将促进线虫的产业化。 为探索共生细菌产生的胞内晶体蛋白在共生系统中的生物学功能,本论文从P.luminescens H06菌株中扩增其编码基因cipA、cipB,并分别在原核(大肠杆菌)和真核(酿酒酵母)表达系统中表达,然后分别将重组菌株与三种昆虫病原线虫[Steinernema longicaudum X-7(X-7)、S.carpocapsae All(All)和Steinernema sp.Sy-5(Sy-5)]以及海洋饵料线虫Panagrellus redivivus共培养,生物测定所表达的目的蛋白对线虫生长发育的影响。 结果表明:H06菌株的cipA和cipB序列与业已报道的Hm菌株对应序列的同源性均为93%。 在构建pCR4-TOPO-cipA和pCR4-TOPO-cipB克隆载体的基础上,论文构建了两种原核高效表达载体pET-15b-cipA及pET-15b-cipB,以化学转化法对蛋白酶缺陷型大肠杆菌BL21(DE3)进行转化并在抗性平板上筛选出阳性克隆。所构建的重组质粒在宿主菌中具有良好的稳定性,无选择压力下传代培养,目的蛋白表达量保持在菌体总蛋白的27%~35%。重组CipA及CipB蛋白的诱导表达量分别达到30.9%和32.6%,均于胞内形成包涵体蛋白,胞外未有目的蛋白的渗漏表达。以温和的、非机械破壁方法初步纯化重组CipA、CipB蛋白以及H06菌株产生的Cip蛋白混合物,三者的得率分别为:78.8%、88.9%、89.1%。通过五次免疫新西兰大耳兔分别获得CipA及CipB的多克隆抗血清,间接ELISA法监测免疫过程实验动物血清中抗体的产生情况;免疫印迹检测说明由大肠杆菌大量表达的重组蛋白即为P.luminescens H06菌株的两种胞内晶体蛋白CipA和CipB。 生物测定发现:液体培养状态下,胞内晶体蛋白作为线虫重要的营养来源,并与第二代感染期线虫的形成直接相关。以可大量表达重组胞内晶体蛋白的大肠杆菌分别与无菌一龄Steinernema longicaudum X-7、S.carpocapsae All以及Steinernema sp.Sy-5线虫建立固体及液体培养组合,结果表明,在液体培养系统中,除了All品系线虫在CipB蛋白中未能完成发育外,所有测定线虫都能够于存在至少一种Cip蛋白的组合中完成世代,获得感染期线虫,没有Cip蛋白存在的组合,未能获得感染期线虫;固体培养系统中,测定线虫可在所有组合中完成世


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