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红法夫酵母酶法破壁提取虾青素及其β-环糊精包合的研究

蹇华丽  
【摘要】:红法夫酵母坚韧的细胞壁严重阻碍了其细胞内虾青素的提取及应用,因此建立合适的细胞破壁方法以提高虾青素的生物利用度及提取率是一个急需解决的关键问题。本论文研究了环状芽孢杆菌胞壁溶解酶的发酵生产及其用于红法夫酵母破壁提取虾青素,以及红法夫酵母虾青素的稳定性及其β-环糊精包合保护方法,主要实验结果如下: 对环状芽孢杆菌B.circulans A1.383进行紫外线诱变处理,经过初筛、摇瓶复筛以及传代稳定性实验,获得一株稳定高产胞壁溶解酶的突变株A1.383-2,其胞壁溶解酶产量比亲株提高了116.9%。通过对其发酵产酶条件的优化实验,得出其生产胞壁溶解酶的适宜条件:碳源采用酵母葡聚糖,浓度为10g/L;氮源为蛋白胨与(NH_4)_2SO_4混合,使其总浓度为4g/L;接种量6%~10%(v/v);摇瓶装液量为250mL三角瓶装液40mL;发酵温度为30℃~35℃;培养基初始pH6.5~7.0。在上述条件下发酵54h后可获得最高酶活74.6u/mL,比优化前酶活提高了38.7%。 通过单因素及均匀实验设计,确定了将B.circulans A1.383-2胞壁溶解酶用于红法夫酵母破壁提取虾青素的最佳酶作用条件,即当pH值为5.0,加酶量为1614.5u/g干酵母,37℃温和震荡反应16.5h,虾青素的提取率可达到98%以上;此胞壁溶解酶稳定的pH值范围为4.8~9.8,在50℃以下表现出很好的热稳定性;对此胞壁溶解酶中多种酶活进行了测定,确定该复合酶含有β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶、中性蛋白酶、几丁质酶、淀粉酶以及木聚糖酶活性。 2-脱氧-D-葡萄糖的存在会影响葡萄糖的正常代谢以及酵母细胞壁的合成,但实验表明,红法夫酵母培养中添加0.005g/L-0.02g/L的2-脱氧-D-葡萄糖却可促进虾青素积累,而且生物量基本保持不变,在增加虾青素产量的同时还能缩短酶法破壁的时间。当2-脱氧-D-葡萄糖添加浓度为0.02g/L,且在红法夫酵母培养的前36h添加时,虾青素含量可提高到对照组的113.7%,采用胞壁溶解酶对红法夫酵母破壁提取虾青素,作用12h提取率可达94.7%。推测2-脱氧-D-葡萄糖促进虾青素合成的机理是由于其在细胞内抑制了电子传递链的某个酶,从而阻断呼吸链,造成氧自由基的大量积累,促使虾青素的合成。 通过对红法夫酵母与环状芽孢杆菌两阶段混合培养条件的优化,总结出红法夫酵母产虾青素及酶法破壁提取的适宜工艺为:培养基初始糖浓度为30g/L,环状芽孢杆菌的最佳接种时间为红法夫酵母培养60h~72h,接种量为10mL/L(10~(10)个细胞/mL),接种后最适培养温度为30℃,pH为6.5,总发酵时间为120h,在此条件下,红法夫酵母虾青素产量可达到8960.2μg/L,虾青素最终提取率可达到96.8%。在两阶段混合培养实验结果的基础上,设计了红法夫酵母与环状芽孢


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