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新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究

范晓丹  
【摘要】:豆豉纤溶酶是从中国传统的大豆发酵食品——豆豉中发现的新型纤溶酶。这种酶不仅具有较高的纤溶活性,而且无毒副作用,不引起内出血,在体内半衰期长。因此豆豉纤溶酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品,都具有十分重要的开发价值。然而,现有的相关研究主要集中在纤溶酶产生菌种的筛选、发酵条件的优化等方面,对于豆豉纤溶酶的分离纯化及酶学性质的研究非常有限,对其核苷酸和氨基酸分子水平的研究更为鲜见。基于以上情况,为了获得具有自主知识产权的新型纤溶酶,本论文从广泛收集的各种豆豉成品及半成品中筛选具有纤溶活性的菌株,并进行菌种鉴定;采用物理和化学手段分别对筛选到的菌株进行诱变;对纤溶酶产生菌的突变株进行发酵条件优化;对纤溶酶进行分离纯化工艺路线的研究;另外,采用PCR技术扩增豆豉纤溶酶成熟肽编码区片段,进行核苷酸序列测定,并推导出其氨基酸序列与其它纤溶酶进行同源性分析;为了进一步验证该纤溶酶是否为新型的纤溶酶,我们对该纤溶酶的酶学性质进行了系统的研究。 从全国各地广泛收集的豆豉成品与半成品中,筛选到6株菌落形态各异,纤溶酶产量不同的菌株。其中,菌株DC-12具有最高的纤溶酶产量,其纤溶酶活性为200IU/mL,比酶活为101IU/mg。对菌株DC-12进行菌落形态、菌体特征的观察以及生理生化实验,鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。将菌株DC-12提交至广东省微生物分析检测中心进行权威鉴定,鉴定结果与实验结果相符,证明DC-12确为枯草芽孢杆菌。 首次采用亚硝酸对枯草芽孢杆菌DC-12进行化学诱变,得到两株突变菌株DC-12N8和DC-12N10,其纤溶酶产量比野生型菌株分别提高了3.6和3.7倍,为720IU/mL和740IU/mL。对枯草芽孢杆菌DC-12进行紫外线诱变,得到一株突变株DC-12U8,其纤溶酶产量比野生型菌株提高了4.7倍,达到950IU/mL。对这三种突变株进行了遗传稳定性分析实验,结果表明DC-12N10和DC-12U8的高产纤溶酶特性在传代过程中逐渐减弱,而DC-12N8具有良好的遗传稳定性,经连续10代传代,纤溶酶产量仍然很稳定,因此,选择DC-12N8作为本论文研究的出发菌株。 经过发酵培养基优化,突变株DC12-N8高产纤溶酶的最佳碳源为可溶性淀粉,浓度为3%;最佳复合氮源为大豆蛋白胨和酵母膏,浓度分别为3%和0.5%;最佳无机盐组合为:0.6%K_2HPO_4,0.1%KH_2PO_4,0.075%MgSO_4,0.02%CaCl_2。突变株DC12-N8发酵高产纤溶酶的最佳培养条件为:150mL三角瓶中装液量30mL;调节培养基初始pH为7.0;以3%接种量接入经过24h培养的种子培养液;在30℃、150r/min条件下进行振荡培养。在最佳发酵培养基和发酵条件下,突变株DC12-N8发酵液可获得的最大纤溶酶产量为2665IU/mL,最大比酶活为1329IU/mg。 枯草芽孢杆菌突变株DC-12N8发酵液经35%~60%硫酸铵分段盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤,可获得电泳纯的豆豉纤溶酶。每升发酵液经过一系列的分离纯化,可获得4.5mg活性蛋白,每毫克蛋白活力达69788Iu,纯


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