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鳙鱼蛋白控制酶解及酶解物抗氧化研究

李琳  
【摘要】: 本文以大宗蛋白资源-鳙鱼(Aristichthys nobilis)为原料,以清除自由基活性为指标,利用控制酶解技术对鳙鱼肉蛋白进行了酶解,制备出具有自由基清除活性的富肽酶解物并分别在化学反应体系、体外模拟体系、亚油酸氧化体系及动物模型体系中对酶解物进行评价,确定该酶解物具有抗氧化和延缓衰老的生理效应;为满足应用开发的要求,采用生物脱腥手段改善酶解物的感官质量并研究其在不同环境及加工条件下的稳定性;最后利用超滤结合离子交换层析技术对酶解物进行工业化分离纯化,并探讨其抗氧化机理。 研究结果表明鳙鱼蛋白经酶解后可显著提高清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH?)、羟基自由基(?OH)及超氧阴离子自由基(O2?-)的能力,但这种能力会受到酶种类、酶解时间等因素的影响;比较木瓜蛋白酶、Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、Protamex及胰蛋白酶等单酶、复合酶解特性及酶解液对自由基的清除效果,确定Alcalase为鳙鱼蛋白制备抗氧化肽的最适酶;在此基础上,利用人工神经网络(ANN)对酶解过程进行仿真模拟并优化酶解条件,确定了制备分别具有最强清除DPPH?、?OH及O2?-自由基的三种酶解物(A、B、C)的酶解工艺;对三种酶解物的理化特性进行评价后确认酶解物中肽所占比例高达65%以上,为富肽酶解物;分别在化学反应体系、体外模拟体系及亚油酸氧化体系中对三种酶解物的抗氧化活性进行评价,确定酶解物清除DPPH?、?OH及O2?-的EC50分别为2.509mg/ml,4.11 mg/ml及6.892 mg/ml;比较三种酶解物的还原能力和对脂肪氧合酶的抑制活性,发现三种酶解物均具有一定的还原能力但弱于抗坏血酸,50mg/ml的酶解物可抑制50%的脂肪氧合酶活性;在体外模拟条件下考察酶解物对家兔肝脑组织中丙二醛(MDA)产生,家兔红细胞自溶血和肝线粒体肿胀的影响,发现酶解物均具有抗氧化效果且呈剂量相关性;同时利用硫代巴比妥酸比色法(TBARS比色法)和紫外吸收法比较了酶解物在亚油酸氧化体系中MDA及共轭二烯(CD)的产生情况并确定酶解物是通过降低CD的产生而实现对不饱和油脂的抗氧化;综合评价三种酶解物的抗氧化能力后确定酶解物C(鳙鱼蛋白肽粉)的抗氧化活性最强; 分别利用果蝇寿命实验和D-半乳糖致衰小鼠实验评价鳙鱼蛋白肽粉延缓衰老的生理效应。通过比较雌雄果蝇的半数死亡时间、平均寿命及最高寿命确定1%的肽粉可极显著延长果蝇寿命;分别利用羟胺比色法、5,5’-双硫代对硝基苯甲酸(DNTB)比色法、TBARS比色法、紫外比色法及磷法等对D-半乳糖致衰小鼠血清、肝脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性、肝脑组织中MDA的生成、肝脑组织中单胺氧化酶(MAO-B)的活性及心肌线粒体中Ca2+-Mg2+-ATP酶(Ca2+泵)、Na+-K+-ATP酶(Na+泵)等的活性进行测定后确定灌胃鳙鱼蛋白肽粉可延缓致衰小鼠的衰老;同时通过碳粒廓清实验及胸腺、脾脏指数等的比较推测其可能具有非体液免疫的功能; 比较了几种脱腥方式的脱腥效果和对活性的影响,确定以酵母添加的方式实现脱腥;考察不同干燥方式、不同pH环境、热处理、不同杀菌方式及模拟消化道环境中肽粉的活性保持,发现喷雾干燥对肽粉的活性影响较小;肽粉在酸性中性环境中可保持95%以上的活性,肽粉具有很好的热稳定性,适合采用沸水灭菌;在模拟消化道环境中肽粉可保持75%以上的活性; 利用超滤结合离子交换层析技术对鳙鱼蛋白酶解物进行分离后可提高其抗氧化活性,清除DPPH?的EC50由原来的2.739mg/ml降低为0.625mg/ml;利用扫描电镜(SEM)观察了分离物对红细胞受到?OH攻击时的保护作用;利用Ferrozine结合法考察了不同分离程度的酶解物对Fe2+的结合能力发现Fe2+结合能力与抗氧化活性呈正相关,最后探讨了Fe2+结合能力、分子量大小、氨基酸组成与抗氧化活性的关系。


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