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利用低次烟叶蛋白制备生物活性肽及烟用香精的研究

饶国华  
【摘要】: 本文利用碱溶酸沉法从低次烟叶中提取出可溶性蛋白质,研究了低次烟叶蛋白酶解物抗氧化和抑菌活性的变化规律,并通过超滤膜分离,确定了活性最强的肽段,同时以低次烟叶蛋白酶解物为原料,通过Maillard反应制备高质量的烟用香精。研究得到如下结论: 烟叶蛋白提取过程中磨浆工艺的最佳水平组合为固液比1:17,提取液温度60℃,提取液pH8.0,磨浆两次;碱溶最佳工艺:温度60℃,pH8.0,时间60min,搅拌条件下提取三次;酸沉过程中,pH3.0,4℃静置8hr效果最佳。蛋白酸沉提取率最高为86.71%,产品中蛋白质含量为70.66%。B1K级烟叶蛋白中必需氨基酸含量最高(41.80%)。 低次烟叶蛋白利用不同蛋白酶(Papain、ProtamexTM和Alcalase2.4L)进行酶解,以水解度和肽提取率为指标,以Papain酶解效果最好,通过单因素和正交试验表明:Papain酶解低次烟叶蛋白最优条件:酶用量1.25%、pH6.5、60℃、底物浓度8.00%、搅拌下酶解6hr,肽提取率相对最高为37.42%。游离氨基酸含量随酶解时间的延长而增加,酶解24hr后水解产物中游离氨基酸总量为未酶解样品中的15倍左右。 建立了木瓜蛋白酶酶解低次烟叶蛋白的动力学模型: 酶失活动力学常数k d=0.0077 min-1;对酶解动力学模型验证表明,该酶解动力学模型在0-300min范围内与实际结果基本相吻合。 酶解液体外抗氧化活性以5kDa组分最高。Papain酶解液对超氧阴离子自由基的抑制率最高(28.41%),接近VE(28.56%),ProtamexTM酶解液的抑制率次之(25.48%),Alcalase2.4L酶解液抑制率最低(24.55%)。清除DPPH自由基的能力以Papain酶解液最高为83.82%,ProtamexTM酶解液的清除率次之为80.08%,Alcalase2.4L酶解液清除率最低为71.93%,但均比VE差(93.24%)。三种酶解液清除羟自由基清除的能力依次为:Alcalase2.4L酶解液(67.18%)ProtamexTM酶解液(65.42%)Papain酶解液(64.17%)。酶解液抗氧化活性组分分子量集中在3-5kDa。 酶解液(酶解6hr)中,色氨酸、组氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量,在经Papain酶解后的原液和经5kDa超滤膜处理的透过液中均最高,分别为45.87mg/mL酶解液和81.44mg/mL酶解液,而经Alcalase2.4L酶解后,四种氨基酸的总含量均最低,分别为42.89mg/mL酶解液和79.18mg/mL酶解液。酶解液和经5kDa超滤膜处理的透过液的氨基酸组成有明显差异。 低次烟叶蛋白经Papain酶解后的酶解液具有抑菌活性,且只抑制大肠杆菌的生长,酶解6hr的酶解液抑菌效果最好,其中以5kDa酶解液抑制效果最佳,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.40g/L,高于尼泊金丙酯对大肠杆菌的最低抑菌浓度(0.35g/L)。pH值对5kDa酶解液抑制大肠杆菌活性的影响不明显,pH3.0-10.0时,5kDa的酶解液能高效抑制大肠杆菌的生长繁殖;高温处理对5kDa酶解液的抑菌能力影响不明显,5kDa酶解液具有良好的耐热性。 液质联用分析结果表明:膜超滤方法能高效实现对低次烟叶蛋白酶解液的初级分离。 复合酶解技术深度酶解低次烟叶,氨基酸转化率最高达36.94%,明显优于单酶酶解效果。 利用低次烟叶深度酶解液,通过Maillard反应制得的烟用香精,给烟草制品增香调味效果明显,评吸评分最高为96分。通过气质联用色谱分析表明:Maillard反应产物的醚溶性成分中酸、醇、酯成分含量较高,特别是具有明显烤烟香味和甜味的成分含量比较高。


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