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草鱼蛋白源抗疲劳生物活性肽的制备分离及鉴定技术研究

任娇艳  
【摘要】: 本文以蛋白含量丰富的草鱼为原料,通过限制性酶解制备抗疲劳活性肽,同时对草鱼蛋白中具有不同溶解性的肌浆蛋白、肌原纤维蛋白及基质蛋白等的酶解特性进行了探索性研究,借助体外化学模型及动物试验评价了草鱼蛋白肽的生物活性,并集成超滤、离子交换色谱、逆流色谱及凝胶色谱等多种分离技术对草鱼蛋白肽进行逐级纯化,最后以液质联用色谱结合氨基酸分析鉴定出肽的一级序列结构,并研究了抗疲劳运动肽饮料的配方及工艺。 草鱼蛋白中水溶性肌浆蛋白、盐溶性肌原纤维蛋白及不溶性基质蛋白的含量分别为33.65±1.71%、61.42±2.78%及3.12±0.87%,用差示扫描量热法对草鱼蛋白进行分析知肌球蛋白、肌动蛋白热变性温度分别为51.49°C和76.45°C,而肌浆蛋白和胶原蛋白的热变性峰重叠,变性温度均为59.83°C。 选用木瓜蛋白酶、PTN6.0、菠萝蛋白酶、Neutrase1.5MG及Alcalase2.4L分别酶解肌浆、肌原纤维和基质蛋白,筛选出三类蛋白的最适作用酶系分别为木瓜蛋白酶、PTN6.0和Alcalase2.4L,且三类蛋白酶解产物清除羟基自由基能力的顺序为:基质蛋白肌原纤维蛋白肌浆蛋白。将三类蛋白的最佳用酶(即木瓜蛋白酶、PTN6.0和Alcalase2.4L)复配后酶解草鱼全肉蛋白,通过响应面分析法优化酶解条件,得到最优条件下酶解物羟自由基清除率的IC50值为155.89±11.21μg/mL。 用6种体外化学模型综合评价草鱼蛋白酶解物(GCPHs)的抗氧化活性,结果表明其对二苯代苦味肼基自由基的清除力与GSH相当,其还原力及清除超氧阴离子自由基的能力比GSH稍弱,但其对Fe2+的螯合力远远高于GSH,同时还表现出一定的抑制红细胞氧化溶血及肝脂质过氧化能力。 大鼠力竭游泳试验结果表明,GCPHs可显著延长大鼠力竭游泳时间,具显著抗疲劳作用,且能显著降低大鼠血清肌酸激酶活性,并对大鼠血睾酮含量具有显著的纠正提高作用,可维持机体内分泌平衡,GCPHs能够在一定程度上减少大鼠体内疲劳代谢产物的蓄积、增加大鼠肌糖原含量,但效果不是十分显著,说明调节机体内分泌平衡是GCPHs发挥抗疲劳作用的重要因素,而调节疲劳代谢产物及能量代谢平衡起辅助作用。 利用膜过滤及系列色谱技术对GCPHs进行逐级分离,发现酶解物中碱性组分对抗氧化活性的贡献比酸性组分大;疏水性组分对抗氧化活性的贡献比亲水性组分大;分子量1~3 KDa的组分对抗氧化活性的贡献比分子量1kDa的组分大。经各级纯化后,以在线连接RP-HPLC的电喷雾离子质谱(ESI-MS-MS)结合氨基酸分析鉴定出功能肽因子的一级结构为Pro-Ser-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Val,分子量966 Da。 GCPHs在中、酸性条件下可保持90%以上的活性,巴氏杀菌对其活性影响也很小,且经体外模拟胃肠消化道酶液处理后其抗氧化活性仍保持为原来的71.87±3.16%,在此基础上研究出草鱼蛋白肽运动性饮料的配方为:草鱼蛋白肽液40% (v/v),生姜提取液5% (v/v),枸杞、菊花及蜜枣混合提取液20% (v/v),蔗糖及葡萄糖各3% (w/v),氯化钠约18 mmol/L,以混酸(柠檬酸钠:柠檬酸:乳酸= 1:2:1)调节饮料pH至4.4,最后补水至所需体积。


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