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抗氧化新型冬虫夏草胞外多糖的制备、结构与溶液特征研究

闫景坤  
【摘要】: 冬虫夏草(简称虫草)[Cordyceps sinensis (Berk.)Sace.]是我国珍稀的药用真菌,具有广泛的生理活性和独特的药用价值,多糖为其中主要活性成分之一。本文旨在从人工培养的冬虫夏草菌(Cs-HK1)菌丝发酵液中分离虫草胞外多糖,确定胞外多糖提取和分离的最佳工艺条件,通过对粗多糖分级分离,获得各种胞外多糖级分,比较各级分的体外抗氧化活性和作用机制,确定抗氧化活性最佳的多糖级分,并进一步纯化,对抗氧化活性纯多糖的理化性质、化学结构、溶液性质和分子链构象进行深入分析,研究结果如下: 采用乙醇沉淀法从人工培养冬虫夏草菌丝发酵液中提取胞外多糖,乙醇浓度95% (v/v),乙醇添加倍数4.3倍,沉淀时间10.5 h和发酵液pH=6.8,胞外粗多糖的产率4.27 g/L,是目前所见报道的各类虫草菌胞外多糖提取的最高水平。化学组成为总糖50.1%、糖醛酸13.6%、蛋白28.4%。 通过脱蛋白、脱色、透析预处理和离子交换柱层析分离分级,得到胞外多糖级分EPS-1和EPS-2。通过体外抗氧化筛选模型,发现胞外多糖EPS、EPS-1、EPS-2通过氢原子转移反应均能较好的清除O_2~(·-)、·OH和ABTS·+自由基,EPS-1的作用效果明显强于EPS及EPS-2,且对·OH自由基具有更好的清除作用,其IC_(50)值与Vc相当,是虫草菌胞外多糖的主要抗氧化活性组分。 EPS-1经凝胶过滤得到纯胞外多糖EPS-1A,紫外光谱、比旋度和凝胶渗透色谱分析表明,胞外多糖EPS-1A为相对均一多糖组分,中性糖含量为99.0%,重均分子量(Mw)为4.0×10~4 Da,比旋度为+6.5o (c 0.26, H_2O),为非淀粉类,不含单糖、糖醛酸、蛋白质、核酸和多酚类物质的水溶中性多糖。 通过酸水解、甲基化、高碘酸氧化、Smith降解、气相色谱(GC)、气质联用(GC-MS)色谱、红外光谱(IR)、1D和2D NMR等,确定EPS-1A的单糖组成为D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖,分子摩尔比15.2:3.6:1.0,主链由(1→6)-α-D-葡萄糖和(1→6)-α-D-甘露糖组成,侧链出现在(1→6)-α-D-甘露糖残基的O-3位置,由(1→6)-α-D-葡萄糖、(1→6)-α-D-甘露糖和非还原性末端的β-D-半乳糖组成,为人工培养冬虫夏草菌(Cs-HK1)菌丝发酵液中发现的一新的多糖结构重复单元。 刚果红反应揭示,EPS-1A在溶液中为无规线团链,通过不同溶液体系中特性粘度、比旋度和粒度分布的变化,推测该多糖在溶液中为柔顺无规线团链构象,在较大浓度易形成聚集。外界条件如温度、金属离子、变性剂和刚果红均不能改变多糖在溶液中的链构象,只是在不同程度上影响多糖分子的分子间或分子内氢键相互作用,使多糖变得松散、无序。 粘度法和静、动态激光光散射分析EPS-1A在0.15 M NaCl水溶液中的构象参数特性粘度([η])、重均分子量(M_w)、均方根旋转半径(S~2(1/2))、水动力学半径(Rh)和特征参数(ρ)分别为6.02 dL/g, 5.03×10~4 g/mol, 133.80 nm, 145.35 nm和0.92,表明该多糖在水溶液呈柔顺无规线团“软球”状链构象,所形成“软球”的硬度要大于右旋糖酐的。原子力显微镜(AFM)显示EPS-1A为大小不等的球状结构,高度和直径分别为2-3 nm和10-50 nm,与右旋糖酐的相似。扫描电镜(SEM)显示胞外多糖EPS-1A的固态形貌为支化度较高的柔顺网状结构。


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