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一株新型白腐菌产漆酶规律及其酶学性质的研究

傅恺  
【摘要】: 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,能够氧化多种酚类和芳胺类化合物,并同时将氧分子还原为水,在某些氧化还原介体存在的条件下,还能够氧化非酚类物质,因此在纸浆生物漂白、工业废水处理、有机染料脱色和高分子催化合成等方面,表现出了很大的研究价值和应用潜力。白黄小脆柄菇是一株分泌木质素降解酶的新型白腐菌,本研究通过对其进行遗传诱变育种,筛选出漆酶高产菌株,优化液体培养产漆酶的条件,初步探索白腐菌漆酶的扩大化生产,并分离纯化漆酶蛋白,研究其部分酶学性质,为后续白腐菌漆酶的工业化生产和应用提供理论基础和依据。 首先以野生白腐菌P. candolleana为出发菌株,通过紫外诱变处理选育漆酶高产菌株,诱变菌株U10-11的液体发酵漆酶最高活力可达4630U/L,比野生菌株的酶活高峰1480U/L提高了约3倍,并且出现产酶高峰的时间比原始菌株提前了约3d。改进液体发酵条件后,白腐菌P. candolleana诱变菌株U10-11产酶能力最高可达约12000U/L,并且发酵体系中只含有少量半纤维素酶,而未检测到纤维素酶活力,因而其木质纤维素降解酶系的脱木素选择性较高,在制浆造纸工业中具有较高的研究和应用潜力。 在摇瓶发酵基础上,研究探索了白腐菌P. candolleana漆酶的初步扩大化生产。对比了不同诱导物质对白腐菌合成漆酶能力的影响,将促进产酶效果最佳者应用于5L机械搅拌式发酵罐的漆酶生产中。结果表明,多种诱导物质都对白腐菌P. candolleana漆酶的合成有显著的促进作用,其中添加1mmol/L的硫酸铜的促进效果最好,摇瓶发酵过程中最高漆酶活力达到23000U/L,比未添加诱导剂的对照样提高了95.1%。在5L机械搅拌式发酵罐的漆酶生产中添加硫酸铜后,白腐菌P. candolleana漆酶产量也有明显提高,第5d时漆酶活力达到峰值9100U/L,与未添加诱导剂的发酵罐漆酶生产相比,提高了约72.3%。 以白腐菌漆酶的发酵罐生产为基础,通过硫酸铵盐析、超滤、离子交换色谱等分离纯化方法,首次获得了白腐菌P. candolleana的纯化漆酶,其比活力达到438.0U/mL,比原始粗酶液漆酶比活力提高了13.2倍,而漆酶总活力损失较小,得率为50.1%。对纯化漆酶部分理化性质的研究结果表明,漆酶的最适反应温度和pH值分别为45℃和5.0,在pH 9.0,温度4-10℃的环境中纯化漆酶具有较好的稳定性,保存16d后,酶活还能够保持为初始酶活的约92.4%。白腐菌P. candolleana漆酶催化氧化底物ABTS的米氏常数Km为0.016 mmol/L,最大反应速度V_(max)为17.27 mmol/(L·min),表现出较高的底物亲和力。多种金属离子对纯化漆酶活力都有不同程度的抑制作用,其中Fe2+离子的抑制作用最强。 采用CTAB法提取了白腐菌P. candolleana的总DNA,DNA溶液的OD260/OD280为1.71,核酸浓度为2906 ng/mL。以此DNA为模板,经过PCR扩增和序列测序后,得到了白腐菌P. candolleana的18s rDNA碱基序列,长度为886 bp。将此序列与Genbank核酸数据库中的菌种序列进行对比可知,本实验所采用的白腐菌P. candolleana 18s rDNA序列与数据库中的菌种Psathyrella candolleana DQ465339.1的同源性最高,与菌株Psathyrella gracilis和Lopharia mirabilis的同源性也较高,均达到了99%。


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