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雨生红球藻表达载体的构建与电转化研究

卢水秀  
【摘要】: 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种重要的经济微藻,在胁迫条件下能积累大量虾青素(astaxanthin),含量可高达干重的4%。进一步提高雨生红球藻的虾青素含量和产量,尚有许多关键技术需要突破,如提高细胞密度、强化虾青素合成代谢途径的调控等。通过基因工程育种来改造雨生红球藻的生物学特性,使之更易于实现高密度培养和高效积累虾青素具有重要意义。目前国际上雨生红球藻遗传转化的研究报道还很少,尚没有电击法成功转化雨生红球藻的报道。 本研究首先采用基因组步移法分离了具有启动子活性的雨生红球藻α-tubulin基因上游的5’-侧翼区域,进而构建了包含α-tubulin基因5’-侧翼区域和Sh ble抗性基因的表达载体,然后建立了雨生红球藻的电转化方法,在转录水平上检测到Sh ble抗性基因的瞬时表达。主要研究结果如下: 1.根据雨生红球藻α-tubulin mRNA序列,PCR扩增得到了α-tubulin基因组序列,序列分析结果表明该序列包含四个外显子和三个内含子。 2.采用基因组步移法分离得到了ATG翻译起始密码子上游914 bp的雨生红球藻α-tubulin基因的5’-侧翼区域。基于启动子数据库的分析表明,α-tubulin基因5’-侧翼序列包含大量的启动子顺式作用元件。与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和团藻(Volvox carteri)的tubulin启动子序列比较发现,5’-侧翼序列中还包含在莱茵衣藻和团藻tubulin启动子中具有重要调控作用的若干元件,包括16 bp保守序列、TATA盒和GC富集区域等。 3.构建了包含雨生红球藻α-tubulin基因5’-侧翼区域和Sh ble抗性基因的表达载体pLSX。 4.采用构建的表达载体pLSX,利用电击法转化雨生红球藻,系统考察了细胞生长阶段和电击条件对电击后雨生红球藻细胞存活率的影响。结果表明:在相同电击条件下,对数早期细胞电击后的存活率明显高于对数中期和对数晚期;方波的电击条件为600 V/cm、2 ms时,或指数波的电击条件为500 V/cm、5.3 ms以及600 V/cm、2 ms时,对数中期细胞的相对存活率约为50%。 5.采用RT-PCR检测到了电转化后ble基因在雨生红球藻中的瞬时表达,同时证明了分离的雨生红球藻α-tubulin基因5’-侧翼区域具有启动子活性。本研究构建的表达载体和建立的电转化方法对雨生红球藻的转基因研究将具有重要应用价值。


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