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无籽沙糖桔自交不亲和泛素降解途径关键基因的筛选

马跃文  
【摘要】:自交不亲和(Self-incompatibility,SI)是被子植物中广泛存在的促进异花授粉,防止近亲繁殖的遗传机制。柑桔无籽是一种优良的经济性状,自交不亲和是导致无籽的重要原因之一。研究表明,自交不亲和反应是一个复杂的过程,可能涉及到泛素降解途径、Ca2+信号途径、发育过程和植物激素信号转导等多种途径。本研究以无籽沙糖桔和有籽沙糖桔为材料,利用转录组测序技术,结合已发表的与自交不亲和相关的基因,筛选出与无籽沙糖桔自交不亲和相关的候选基因14个,并用q-PCR对候选基因进行时空表达分析。主要研究结果如下:1.以无籽沙糖桔和有籽沙糖桔的雌蕊、花粉,无籽沙糖桔自交、异交后不同时段的雌蕊(4 h,1~7 d)六个样品用于转录组测序。共获得35.67 G碱基,306,462,978对双端reads,样品Q20达到96%以上,N50为1549,Unigene平均长度897.99bp。各样品reads数与组装参考基因组比对率均在85%左右,测序数据可靠,可以满足后续实验分析需要。2.根据表达量RPKM值及注释信息,以FDR≤0.001且倍数差异不低于2倍为筛选条件,在WCPistils-VS-WSPistils中筛选出634条显著差异基因,其中541条上调表达,93条下调表达;在YPistils-VS-WPistils中筛选出6555条显著差异基因,其中2643条上调表达,3912条下调表达;在YPollen-VS-WPollen中筛选出2869条显著差异基因,其中634条上调表达,2235条下调表达。GO功能注释结果表明,这些差异基因涉及到生殖过程、信号传递、免疫过程、刺激应答、分子功能的正负调控、受体活性和转录因子结合蛋白活性等方面。KEGG注释结果表明,这些差异基因主要涉及到植物信号转导途径、泛素/26S蛋白酶体途径、RNA转运以及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等通路。与泛素/26S蛋白酶体途径密切相关的基因主要有:泛素激活酶E1(Unigene0031440);泛素结合酶E2(Unigene0049541和Unigene0034845)和泛素连接酶E3(Unigene0038751、Unigene0031435、Unigene0034401、Unigene0029897、Unigene0023597和Unigene0035181)。3.根据文献报道并结合华中甜橙数据库、KEGG数据库和SSH cDNA文库筛选到SSK-21、SSK-62、SSK-98、Cullin67和Ring 5个与SI、泛素/26S蛋白酶体途径相关的候选基因。4.利用q-PCR对转录组数据进行验证,在鉴定的43个差异基因中,有88.4%的表达趋势与RNA-Seq结果一致,说明转录组数据的可靠性。5.用q-PCR对14个候选基因,在无籽沙糖桔、有籽沙糖桔不同组织以及无籽沙糖桔自交和异交授粉后不同时段(4 h,1、2、3、4、5、6和7 d)和不同组织(柱头、花柱、子房)进行表达特性分析,Unigene0031435、Unigene0038751、Unigene0029897和Ring基因,在异交3 d后的花柱中上调表达,且都具有RING-finger结构域,符合预期表达趋势。表达特性表明,Unigene0031435、Unigene0038751和Unigene0029897可能是泛素/26S蛋白酶体途径中关键酶基因。6.对Ring基因做进一步生物信息学分析,发现该基因与可可(Theobroma cacao)的同源性最高(90.0%),且与拟南芥(Arabidopsis thaliana)MYB30-Interacting E3 ligase1的同源性为84.0%。由于Ring基因在无籽沙糖桔和有籽沙糖桔中的ORF完全相同,而DNA序列只有两个碱基的差别,且位于基因的内含子部分,因此推测该基因可能不是泛素/26S蛋白酶体途径中关键酶基因。


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