长链非编码RNA调控小鼠卵巢发育的初步研究

【摘要】：卵巢是雌性动物生殖系统中重要的器官之一,它的功能主要分为两大方面,一是作为卵母细胞发育成熟的场所,分化出具有受精能力的卵母细胞;二是卵巢分泌的性腺激素调控卵泡发育和生殖周期等。卵巢活动的周期性由多种因素调节,如促性腺激素、细胞因子及核酸分子。长链非编码RNA(lncRNA)能在表观遗传调控,转录调控及转录后调控等层面上调控基因的表达水平,已报道有很多lncRNA参与了生物个体的发育和疾病的发生,成为基因研究的重点领域。卵巢是雌性动物机体生理变化最活跃的器官之一,但目前lncRNA参与调控卵巢发育的研究鲜有报道。为了研究lncRNA在卵巢生殖活动中的功能,本论文设计了四个连续实验,具体的实验设计、研究内容和实验结果如下。实验一:探讨卵巢中特异性表达的lncRNA。首先,分析实验室的lncRNA基因库,从中筛选出16个基因,通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测证实有9个lncRNA在小鼠多种组织中相对高表达,并发现lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274在卵巢组织中相对特异性高表达。实验二:不同卵巢状态下lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274基因的表达丰度。分别检测了这3个基因在小鼠不同发育时期(5日龄、3周龄、5周龄、8周龄)和发情周期不同发情时期(发情间期、发情前期、发情期和发情后期)卵巢中的表达水平,结果发现lncRNA147和lncRNA274在8周龄小鼠卵巢中的表达水平最高,在其它3个发育阶段卵巢中的表达水平从高到低依次为5日龄卵巢,5周龄卵巢和3周龄卵巢;lncRNA647在5周龄和8周龄卵巢中的表达水平最高,在其它2个发育时期卵巢中的表达水平从高到低依次为5天龄卵巢和3周龄卵巢。在发情周期不同发情时期的卵巢中,3个lncRNA的表达水平均按照发情间期、发情前期,发情期和发情后期依次升高,其中在发情后期中的表达水平显著高于其它三个发情时期。实验三:研究这3个lncRNA基因在卵巢中特异表达后对卵巢功能的影响。构建ZP3基因启动子-目的lncRNA基因过表达质粒载体;利用体内转染的方法,在8周龄雌鼠右侧卵巢中分别注射lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274载体,左侧卵巢注射ZP3骨架载体(不含目的基因)。转染72小时后摘取两侧卵巢,分别提取卵巢组织总RNA并反转录为cDNA,检测目的基因和卵泡发育相关基因的表达水平,以及卵巢组织制作石蜡切片并HE染色,观察并统计腔前卵泡、有腔卵泡和黄体的数量。结果发现,卵巢组织中过表达lncRNA274后,与对照组相比卵泡发育相关基因FSHR的表达水平升高了约7倍,LHR升高了约18倍,GDF-9升高了约11倍,BMP-15升高了约7.5倍,EGFR升高了约7.5倍;黄体的数量(13.3±4.9)与对照组(4.3±0.6)相比显著增加,而腔前卵泡、有腔卵泡数量无显著差异。过表达lncRNA147后,与对照组相比FSHR、GDF-9、BMP-15的表达水平无显著差异,LHR升高了约4倍,EGFR升高了约5倍;腔前卵泡、有腔卵泡和黄体的数量与对照组相比无显著差异。过表达lncRNA647后,FSHR、LHR、GDF-9,BMP-15和EGFR的表达水平与对照组相比均无显著差异;腔前卵泡、有腔卵泡和黄体的数量与对照组相比无显著差异。实验四:进一步验证lncRNA274对小鼠排卵的作用。构建了lncRNA274转基因小鼠。通过小鼠1细胞胚胎阶段制作lncRNA274转基因小鼠,分别获得F0代和F1代的转基因小鼠和同窝野生型小鼠,并对其生育能力进行统计,结果发现10#-F0代转基因雌鼠产仔数(10.5±0.6)较同窝野生型小鼠(7.75±1.7)有显著差异,1#-F1代和10#-F1代转基因雌鼠产仔数(11±1.4,10±1.4)较同窝野生型小鼠(7.5±0.7,6.5±0.7)也均有显著差异。F0代和F1代转基因小鼠子代与野生型小鼠子代的体重与体长无明显差异。综合上述实验结果,发现3个在小鼠卵巢中相对特异性高表达的lncRNA(lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274),且它们在8周龄和发情后期的卵巢中表达水平相对较高。体内转染实验发现lncRNA274基因过表达后,卵泡发育相关基因的表达水平明显升高,排卵数量明显增加。构建lncRNA274转基因小鼠并进行表型分析,发现小鼠产仔数显著增加。实验结果表明,lncRNA可促进排卵。