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舟形藻(Navicula sp.N6)废水培养及其转录组分析

毕桂灿  
【摘要】:目前,影响微藻开放式规模化培养的主要问题是外来杂藻的污染,杂藻与目的藻种产生竞争,抢占培养基中营养物质,降低目的藻种产量。硅藻是一类重要的单细胞浮游生物,其生长迅速、含油量较高,因此硅藻是生物能源资源开发的重要选择。硅藻的生长依赖于水体中可溶性硅元素,当水中可溶性硅元素充足时,硅藻生长十分迅速,可以在短时间内迅速成为优势藻种,而其他藻种的生长受到抑制。本文以解决开放式培养的杂藻污染问题为出发点,筛选了一株海洋硅藻,对硅藻进行培养优化;研究硅胁迫条件下,硅藻对3种常见微藻(盐藻、金藻、小球藻)的抑制作用;开展硅藻的废水培养及重金属吸附研究;对氮充足与氮缺乏条件下培养的硅藻样本进行转录组测序,从分子水平解析硅藻脂质代谢途径,为能源硅藻基因改造提供了一些理论依据。本实验初步筛选了一株硅藻藻株舟形藻Navicula sp.N6,该硅藻株生长速度较快,在F/2培养基最适氮源为硝酸钠,也能很好的利用尿素作为氮源。添加不同的有机碳源并不能促进该藻株的生长及油脂积累,选择CO2作为碳源。硅藻Navicula sp.N6生长迅速,在温度20~30℃能较好生长,最适温度22℃,最适pH为8,适当延长收获时间有利于细胞内油脂积累。硝酸钠对其生长影响较大,随着硝酸钠质量浓度升高,生物量也随之从0.73g/L增加到1.43g/L,而油脂含量则从23.18%降低至14.11%。Na2SiO3·9H2O对藻株Navicula sp.N6的生长、油脂含量的影响较大,适合的培养质量浓度为50~100mg/L。发现VB1和生物素有利于Navicula sp.N6的生长和积累油脂。选取对藻株Navicula sp.N6生长和油脂积累影响较大的因素:pH、NaNO3、Na2SiO3作为影响因子,设计响应面试验,得出最优条件为pH 8.86,NaNO3 88.45 mg/L,Na2SiO3 70.78mg/L,生物量、油脂含量从常规F/2培养的1.01 g/L、10.98%提高至1.33 g/L、20.04%。不同浓度硅酸钠条件下的生长曲线,反应出舟形藻Navicula sp.N6、角毛藻Chaetoceros gracilis和菱形藻Nitzschia closterium 3株硅藻对硅酸钠的依赖程度,硅酸钠浓度越高,3株硅藻的生长越好;盐藻Dunaliella salina、小球藻Chlorella sp.和球等鞭金藻Isochrysis galbana 3011在较低浓度的硅酸钠培养基中能较好的生长,当浓度超过150mg/L时,其生长受到抑制。单独培养时,硅酸钠浓度的提高,显示舟形藻、角毛藻和菱形藻3株硅藻的生物量呈上升趋势,但是油脂含量缺呈现下降趋势;高浓度的硅酸钠不仅抑制盐藻、小球藻球等鞭金藻的生长,其油脂代谢过程也受抑制,生物量和油脂含量都较低。不同浓度硅酸钠下混合培养、最优条件和硅缺乏条件下培养、最优条件下混合培养的试验表明,舟形藻、角毛藻和菱形藻3株硅藻分别与盐藻、小球藻和球等鞭金藻混合培养时,低浓度硅酸钠时藻株的生长都较好。当硅酸钠浓度大于100mg/L或者150mg/L,发现盐藻、小球藻和球等鞭金藻无法利用营养物质生长,与3株硅藻的竞争处于劣势,3株硅藻则能很好利用充足的硅盐和氮、磷等其他营养成分迅速生长,成为优势种群。通过控制水体中可溶性硅元素及氮磷的量,从而控制硅藻的生长速度,保证硅藻在水体中的优势,抑制其余藻种的污染。利用废水培养舟形藻Navicula sp.N6,其生物量分别为0.97g/L(生活废水)、0.68g/L(养殖场废水)和1.21 g/L(混合废水),相对于单一生活废水和单一的养殖场废水,舟形藻Navicula sp.N6在混合废水中培养生物量有明显的提高。舟形藻Navicula sp.N6在混合废水(90%生活废水+10%养殖场废水)培养中的氮磷去除率分别为80%、60%;舟形藻Navicula sp.N6在混合废水(85%生活废水+15%沼气发酵废水)培养中的氮磷去除率分别为92%、86%,显示了舟形藻在废水中良好的氮磷去除能力。与F/2培养基相比,舟形藻Navicula sp.N6的碳水化合物有所增加,蛋白质含量变化不大,油脂含量稍有下降。舟形藻Navicula sp.N6吸附Ni2+、Cd2+试验表明:在对数生长期14d的舟形藻Navicula sp.N6有较强的吸附能力;随着吸附时间的增加,对Ni2+、Cd2+的吸附效果越高;Ni2+、Cd2+浓度的提高也促使舟形藻Navicula sp.N6吸附率提高。对氮充足及氮缺乏条件下培养的舟形藻Navicula sp.N6进行转录组测序,总计得到raw reads约为4.5千万条,碱基总量约为5.5 Gb。利用Trinity软件的Cluster模块,选择来自于同一基因的最长转录本作为Unigene,最终得到59863条长度在201~17616bp的Unigenes,平均长度为858bp,N50为1501bp,低于1000bp和高于1000bp的Unigene分别为43874和15989条,各占总数的73.29%和26.71%。采用NCBI blast、Hmmscan、Blast2GO和KAAS软件,将Unigenes与Nr、Nt、SwissProt、KOG、GO、Pfam、KEGG数据库做比对,得到36127条具有功能注释的Unigene并进行GO、KOG和KEGG PATHWAY分类。预测构建了脂肪酸的合成、延长、代谢途径,并识别了关于微藻细胞生长死亡和其他途径的大量基因,为进一步研究舟形藻Navicula sp.N6提供理论基础。


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