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荔枝霜疫霉效应分子的筛选及PlPAE5的功能分析

万琅  
【摘要】:荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的霜疫病极大影响了荔枝的生长发育,是荔枝生产上为害最重的病害。病原菌的效应分子通常在与植物互作过程中起决定性作用,但关于荔枝霜疫霉中效应分子的研究,目前仅有生物信息学分析而尚未见相关功能的研究报道。本研究首先利用农杆菌介导的瞬时表达技术对荔枝霜疫霉的效应分子进行了初步筛选,发现Pl111352和Pl108620能引起烟草细胞的过敏性坏死(hypersensitive response,HR),PlPAE5可促进疫霉菌在烟草上的侵染。对其中具有果胶乙酰酯酶活性的效应分子PlPAE5进行了较深入的研究,证明其是在侵染初期上调表达的致病因子。具体结果如下:1.荔枝霜疫霉效应分子的筛选:通过将前期生物信息学分析选出的71个效应分子构建到植物表达载体PVX::HA和pBIN::RFP上,将蛋白在烟草细胞中进行瞬时表达,并采用Western-blot技术对随机选择的10个蛋白在烟草细胞中表达的稳定性进行验证,共获得3个具明显表型的效应分子,为2个能引起烟草发生过敏性坏死的蛋白Pl111352和Pl108620,及1个能显著促进辣椒疫霉侵染的蛋白—果胶乙酰酯酶PlPAE5。2.PlPAEs的转录模式分析:通过生物信息学分析,在荔枝霜疫霉基因组中发现5个PlPAE5的同源基因,这类蛋白在疫霉和腐霉中保守存在,但功能研究尚未见报道;对荔枝霜疫霉PAEs(Pectin acetylesterase)进行转录模式分析,发现有信号肽的PlPAE4和PlPAE5在荔枝霜疫霉侵染初期较菌丝阶段表达量显著上升。3.PlPAE5在致病过程中发挥作用:通过CRISPR/Cas 9技术对PlPAE4和PlPAE5进行敲除,试验发现仅利用sgRNA、Cas9载体时未得到敲除突变体,而同时加入替换载体pBSSK::PlPAE5后可以得到PlPAE4和PlPAE5敲除突变体;对PlPAE4和PlPAE5的敲除突变体进行表型分析,发现PlPAE4敲除后不影响其生长速率及致病力,PlPAE5基因敲除后对生长速率、细胞壁胁迫压力也不影响,但对荔枝嫩叶的致病力显著降低;随之对PlPAE5基因进行过表达,通过致病力试验,发现PlPAE5基因过表达后也显著降低对荔枝嫩叶的致病力,推断极可能是由于过表达后触发了植物防卫基因的表达而产生防卫反应。4.PlPAE5的毒性功能依赖于PAE结构域:通过生物信息学分析PlPAE5中保守PAE结构域,设计其缺失突变体PVX::PlPAE5~(1-80aa)、PVX::PlPAE5~(1-165aa)在烟草中表达,在表达处接种辣椒疫霉,试验结果发现仅缺失了PAE结构域的突变体PVX::PlPAE5~(1-80aa)不能促进辣椒疫霉侵染烟草,表明PAE结构域是PlPAE5促进辣椒疫霉侵染烟草的关键区域。


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