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荔枝霜疫霉M90和MAPK10的功能分析

江立群  
【摘要】:由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)引起的霜疫病是我国荔枝生产过程中为害最严重的病害。该病原菌隶属卵菌,为二倍体生物且在遗传进化上与真菌的亲缘关系甚远,致使用于防治真菌病害的广谱性杀菌剂对其防治效果不佳,且先前的基因敲除技术不适于研究其功能基因。本研究基于聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化技术与外源双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的转录后基因沉默策略对荔枝霜疫霉M90与MAPK10两个基因在病原菌生活史和致病性方面的作用与功能进行了研究,主要结果如下:1.通过对荔枝霜疫霉全基因组进行分析,筛选到一个与致病疫霉(Phytophthora infestans)RNA结合蛋白M90相似度达73%的同源蛋白,将其命名为Peronophythora litchii M90(PlM90)。对荔枝霜疫霉M90蛋白与致病疫霉、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、拟南芥霜霉(Hyaloperonospora arabidopsidis)、向日葵霜霉(Plasmopara halstedii)、烟草霜霉(Peronospora tabacina)等卵菌及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等模式生物的该同源蛋白进行序列比对与系统发育分析,结果表明M90同源蛋白普遍存在于真核生物中,且在卵菌中高度保守,尤其是其RNA结合结构域。2.采用实时荧光定量RT-PCR技术对荔枝霜疫霉M90基因在不同生长发育时期与侵染阶段的转录水平进行了研究,结果显示M90基因在孢子囊、游动孢子、休止孢阶段的转录水平是菌丝阶段的2~3倍,在卵孢子阶段的转录水平是菌丝阶段的24倍,在休止孢萌发与侵染阶段的转录水平均明显低于菌丝阶段,表明M90基因可能参与调控荔枝霜疫霉有性生殖与无性生殖过程,而在侵染过程中的作用相对较弱。3.构建pHAM34::PlM90基因沉默载体并通过PEG介导的原生质体转化、基因组PCR验证及实时荧光定量RT-PCR分析,成功地筛选到3个荔枝霜疫霉M90基因沉默转化子,沉默效率分别为98.9%、99.7%和99.6%。对荔枝霜疫霉M90基因沉默转化子进行卵孢子产量、菌丝生长速率、孢子囊产量、游动孢子释放与休止、休止孢萌发及致病性等测定试验,结果显示:3个M90基因沉默转化子的卵孢子产量分别比荔枝霜疫霉野生型减少99.6%、95.4%和97.3%,菌丝生长速率明显减慢但更加致密,游动孢子的释放与休止过程均滞后,而孢子囊产量、休止孢萌发与致病性方面均无明显差异。以上结果表明M90基因的沉默严重影响荔枝霜疫霉的有性生殖过程,还影响其菌丝生长、游动孢子释放与休止等无性发育阶段,而不影响其孢子囊产量、休止孢萌发及致病性。4.对荔枝霜疫霉野生型与两个M90基因沉默转化子转录组测序进行了分析,结果显示两个M90基因沉默转化子有236个相同基因表达上调、101个相同基因表达下调。经基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析显示,约40%上调与34%下调表达基因可归入生物学过程(biological process),约28%上调与25%下调表达基因可归入分子功能(molecular function),约32%上调与41%下调表达基因可归入细胞组成(cellular component)。用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)进一步分析的结果显示,M90基因沉默转化子的酪氨酸代谢(Tyrosine metabolism)、氰基氨基酸代谢(Cyanoamino acid metabolism)、氨基糖与核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)与花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)4个通路受到显著影响。5.基于荔枝霜疫霉全基因组序列分析,筛选到一个与大豆疫霉促有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)MAPK10相似度达87%的同源蛋白,将其命名为Peronophythora litchii MAPK10(PlMAPK10)。对荔枝霜疫霉MAPK10蛋白与其他卵菌及模式生物中该同源蛋白进行序列比对与系统发育分析,结果表明MAPK10同源蛋白普遍存在于真核生物中,在卵菌中高度保守,尤其是其STKc_MAPK结构域。6.采用实时荧光定量RT-PCR技术对荔枝霜疫霉MAPK10基因在不同生长发育时期与侵染阶段的转录水平进行了研究,结果显示MAPK10基因在游动孢子与休止孢阶段的转录水平与菌丝阶段相比明显上调,在其余阶段的转录水平与菌丝阶段无明显差异。7.构建pTORmRFP::PlMAPK10基因沉默载体并通过PEG介导的原生质体转化、基因组PCR验证与实时荧光定量RT-PCR分析,成功地筛选到3个荔枝霜疫霉MAPK10基因沉默转化子,沉默效率分别为64.1%、69.7%和80.8%。对荔枝霜疫霉MAPK10基因沉默转化子进行菌丝生长速率、孢子囊产量、游动孢子释放与休止、休止孢萌发、卵孢子产量及致病性等测定试验,结果显示:3个MAPK10基因沉默转化子的菌丝生长速率、孢子囊产量与致病性均明显降低,而游动孢子的休止与释放、休止孢萌发及卵孢子产量等方面均无明显差异。8.进一步分析MAPK10基因沉默致使致病性减弱的原因,发现转化子胞外氧化酶的活性不受MAPK10基因沉默的影响,而漆酶的活性受到严重的影响。通过实时荧光定量RT-PCR分析,结果显示荔枝霜疫霉全基因组5个候选编码漆酶基因中Pl137978在3个MAPK10基因沉默转化子的相对表达量明显低于野生型对照。


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