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枯草芽孢杆菌BSF01降解拟除虫菊酯类农药的机理研究

肖盈  
【摘要】:拟除虫菊酯类农药被广泛应用于农业害虫和卫生害虫的防治,有关其残留及危害也日益显露。微生物是决定农药在环境中归趋的重要因素,如何利用微生物降解农药残留已成为环境科学的重点研究方向。本论文测定了枯草芽孢杆菌BSF01对拟除虫菊酯类农药降解特性,鉴定拟除虫菊酯降解产物,分析其降解途径;克隆获得关键降解酶基因,并对其进行原核表达和纯化,测定酶学性质;通过分子模拟对降解酶进行饱和突变来验证其功能;对群体感应转录调控因子基因comA进行克隆及蛋白表达纯化,研究该转录调控因子对降解酶基因转录水平的影响。主要研究结果如下:(1)菌株BSF01降解特性研究。通过Box-Behnken响应曲面优化设计,确定菌株BSF01最佳的降解条件为:温度34.5℃,pH 6.7,接菌量0.11 g/L。在此条件下培养7天,该菌株对50 mg/L高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯的降解率分别为89.4%、89.2%、86.9%、86.5%和76.8%,且降解过程符合一级动力学模型,降解速率常数(k)分别为0.2995、0.3811、0.5164、0.4476和0.4476 d~(-1),降解半衰期(T_(1/2))分别为2.31、1.82、1.34、1.55和2.99 d。菌株BSF01能高度耐受并降解高浓度的高效氯氰菊酯,农药初始浓度为25-400 mg/L时,培养7 d降解率达到60%以上。通过GC-MS鉴定高效氯氰菊酯的降解产物,推导BSF01降解途径如下:高效氯氰菊酯的酯键被水解断裂为两个主要中间产物二氯菊酸和α-羟基-3-苯氧基苯乙腈。α-羟基-3-苯氧基苯乙腈在环境中不稳定,便迅速氧化生成间苯氧基苯甲醛,间苯氧基苯甲醛进一步氧化生成间苯氧基苯甲酸,间苯氧基苯甲酸通过取代等反应生成3,5-二甲氧基苯酚。(2)菌株BSF01降解酶基因的克隆。同源克隆得到枯草芽孢杆菌羧酸酯酶基因ybfK,该基因全长为891 bp,重组质粒pMD19T-ybfK与高效氯氰菊酯共培养7 d的降解率达到48.8%。通过对YbfK蛋白保守域及氨基酸序列比对分析发现,该酶属于第6家族的水解酶,为α/β水解酶,蛋白序列具有酯酶家族典型的“Gly-X-Ser-X-Gly”保守五肽序列。(3)ybfK基因的表达、纯化与酶学性质研究。将ybfK基因重组到pET-32a(+)表达载体中,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行表达。对YbfK重组蛋白进行镍琼脂糖凝胶纯化,经测定,纯化后YbfK重组蛋白的浓度为210.8μg/mL,对高效氯氰菊酯的酶活力为7.5 U/mL。在25℃-45℃之间YbfK蛋白对高效氯氰菊酯表现出较好的降解活性,且能耐受较宽的pH范围(5.0-9.0),YbfK蛋白具有较好的热稳定性和pH稳定性。(4)YbfK蛋白分子模拟及点突变研究。同源建模得到YbfK的三维结构模型,主要由两侧的α螺旋和内部的β折叠组成α/β/α的“三明治”结构。YbfK结合口袋深、形状不规则、袋口较宽,有利于配体进入口袋且能牢固结合。通过分子对接发现,YbfK与高效氯氰菊酯结合位点附近有亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)等疏水性较强的氨基酸残基,它们共同构成了疏水区口袋,YbfK与高效氯氰菊酯之间无氢键作用,主要通过范德华力及其他静电作用力发挥作用。通过丙氨酸突变扫描和饱和突变,预测得到5个YbfK蛋白与高效氯氰菊酯相互作用的关键氨基酸,对它们进行点突变,与高效氯氰菊酯共培养7 d后L64P、K92Y、L130R、F161G和L172G的降解率显著降低,分别为15.2%、27.9%、13.0%、19.3%和34.8%。(5)群体感应在菌株BSF01降解高效氯氰菊酯过程中的作用。克隆了枯草芽孢杆菌群体感应转录调控因子基因comA,该基因全长为645 bp。将comA基因重组到pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌BL21中实现了表达。经测定,纯化后ComA重组蛋白的浓度为2000μg/mL。实时荧光定量PCR结果显示,ybfK基因和comA基因的mRNA的表达量呈现协同变化。当高效氯氰菊酯的初始浓度为50-200 mg/L时,ybfK基因和comA基因mRNA相对表达量随着浓度的增加而上升,当达到400 mg/L时,两者mRNA相对表达量显著下降;培养1 d后,ybfK基因和comA基因mRNA相对表达量相较于对照显著上升,第3-7天时两者mRNA相对表达量有所下降。通过DNA pull-down实验,证明了ComA蛋白与ybfK基因启动子序列在体外存在相互结合作用。


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1 肖盈;枯草芽孢杆菌BSF01降解拟除虫菊酯类农药的机理研究[D];华南农业大学;2016年
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