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荔枝霜疫霉致病相关基因PlBZP32的克隆与功能分析

陈玉彬  
【摘要】:荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫病是荔枝产区普遍发生的一种卵菌病害,严重影响了荔枝果实的产量和质量。目前关于荔枝霜疫霉致病机理研究甚少,从分子水平研究该菌的致病机理,将可为发展新的防治策略提供理论依据。本研究将外源双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)构建到载体上,通过聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化,整合至荔枝霜疫霉基因组进而导致基因沉默,再通过分子手段和表型分析来研究霜疫霉相关功能基因及其对生长发育和致病性的影响,主要研究结果如下:将荔枝霜疫霉野生型菌株转接到含遗传霉素不同浓度的胡萝卜培养基上,根据其生长情况,确定了覆盖和筛选的终浓度分别为10μg/mL和30μg/mL。通过对荔枝霜疫霉全基因组进行生物学信息比对分析,鉴定到一个与大豆疫霉(Phytophthora sojae)bZIP-PAS结构串联的转录因子BZPc32同源率达93%的基因,命名为Peronophythora litchii BZP32(Pl BZP32)。应用生物信息学方法,对荔枝霜疫霉PlBZP32蛋白和其他卵菌及模式生物进行同源序列比对与系统发育分析,结果表明,该类转录因子只在低等真核生物中如卵菌和藻类中存在。以pTOR::mRFP为载体,将Pl BZP32基因正向构建到该载体上,经过PEG介导的原生质体转化,得到带有红色荧光的转化子。使用细胞核特异染料DAPI对菌丝和孢子囊染色,分别用紫外光和绿光激发,发现蓝色荧光所指示的细胞核位置与RFP红色荧光较强区域重叠,表明该基因定位在细胞核中。通过PCR扩增到PlBZP32基因后反向构建到p TOR::mRFP载体上,经PEG介导将重组载体转入原生质体中。经过PCR验证和qRT-PCR分析,成功获得T15、T21和T35共3个沉默转化子,沉默效率分别为35.9%、30.8%和38.9%。与野生型SHS3相比,PlBZP32基因的沉默虽不影响转化子菌落生长速率,但导致其孢囊梗分枝增多且节间变短,孢子囊的数量也有显著增加,休止孢的萌发率显著下降。荧光增白剂和刚果红的敏感性检测表明,PlBZP32沉默转化子对其常规浓度的敏感性与野生型没有明显差别。但在对十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的敏感性检测时,沉默转化子的敏感性增强。过氧化氢平板检测结果表明PlBZP32沉默转化子对氧化胁迫敏感性增强,但实时荧光定量PCR结果显示PlBZP32的转录水平并不因氧化胁迫而发生明显改变。平板酶活检测结果表明,Pl BZP32沉默转化子的胞外氧化酶和漆酶的活性均较野生型减弱。病菌菌丝块离体接种荔枝叶片的发病结果显示,Pl BZP32沉默转化子引致的病斑明显比野生型的小,表明其致病力减弱。


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