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红树林植物海马齿耐盐相关基因克隆

曾会才  
【摘要】: 土壤盐渍化是影响农林业生产和生态环境的严重问题,目前全世界约有9.6亿公顷盐渍土,占陆地面积的三分之一,我国的盐渍化土地近1亿公顷,给农林业生产造成了重大损失。如何利用和开发盐渍化土地,提高作物产量和改善生态环境是全世界面临的重大课题。各国科学家都为此做出了不懈的努力,在植物耐盐机理、耐盐相关基因克隆和盐诱导信号传导途径研究等方面取得了许多令人鼓舞的进展。二十多年来的盐碱地改造和农作物耐盐育种的实践证明,开发耐旱、耐寒、耐盐渍基因,培育出高度耐旱、耐寒、耐盐渍的植物品种是开发利用盐渍化土地的最根本、最经济和最稳妥的途径。红树林植物长期生长在海水中,是真正意义上的耐盐植物,是最宝贵的耐盐基因资源库。克隆红树林植物的耐盐基因对于红树林植物耐盐分子机理的研究和我国上亿公顷盐渍土的开发利用具有重大意义和十分广阔的应用前景。 本项研究以红树林植物番杏科海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)为材料,通过耐盐单株无性繁殖和淡水诱导筛选,获得了海马齿6号(SP6)耐盐单株的不耐盐植株群体。通过RNA提取技术的研究,建立了一套新的红树林植物海马齿Total RNA大量提取技术方法。通过抑制消减杂交(SSH),获得了包含241个克隆的海马齿耐盐相关基因的EST表达文库。Reverse Northern Dot-Blot鉴定结果显示这241个克隆中有61个杂交结果呈阳性。从这61个克隆中选取23个阳性克隆进一步进行Northern Blot鉴定,获得了9个杂交结果呈阳性的克隆,这9个克隆是23、66-1、84、89-1、97、108、152、175、233,其中以152、175和233在X-光片上的杂交信号强弱差异最明显。 通过测序和计算机联网至NCBI进行BLASTN和BLASTX分析,分析结果表明: (1)66-1、97、175、233等4个克隆在核酸数据库和蛋白质数据库中未见有显著性相关的同源性片段,说明这4个克隆为未知新基因cDNA片段。 (2)152与拟南芥类似晚期胚胎发生高丰度蛋白基因和杏的晚期胚胎发生类似蛋白基因具有高度的同源性。 (3)84与牛角花的天冬氨酸转氨酶基因具有高度同源性。 (4)89-1与拟南芥的NADPH醌氧化还原酶基因具有高度同源性。 (5)23与烟草启发子诱导的β-1,3-葡聚糖酶基因及拟南芥的糖基水解酶家 族基因17和6*,3-葡聚糖类似蛋白基因具有较高同源性。108号克隆尚未做测 序分析。 通过RACE技术对152和233两个差异片段进行全长CDNA克隆,获得了 152的全长 CDNA序列和 233的 3’。CDNA序列。 计算机联网分析结果表明,152全长 CDNA由 131 3hp组成,其阅读框架长 1035hp,推知编码一个 344个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为 38.5 kD,等电 点PI=4.gi,没有典型的疏水性区域和跨膜螺旋区,亲水性氨基酸残基229个, 占整个氨基酸组成的66.56%,为酸性亲水性蛋白质。其结构功能域中包含1个 28个氨基酸残基的信号肽O L2个晚期胚胎发生高丰度蛋白LEA毛结构 域(56-206,205-323)、2个保守分泌蛋白 COG5608结构域(72-200,174-281) 和3个低复杂度区门*,4265,329习44*其h级结构中存在有大量的卷曲 螺旋区。与同源性最高的拟南芥类似晚期胚胎发生高丰度蛋白比较,二者都具 有LEA-2结构域、保守分泌蛋白COG5608结构域和低复杂度区,都具有PKC- 磷酸化位点、酪蛋白激酶*磷酸化位点、N-十四酞化位点和酚胺化位点,所不 同的是:()在结构功能域上,152全长 CDNA编码的蛋白质序列中多了 1个 LEA-2结构域、l个保守分泌蛋白COG5608结构域和1个低复杂度区;(2)在 功能位点上,152全长 cDNA编码的蛋白质具有酪氨酸硫酸化位点、多了 l个 酪氨酸激酶磷酸化位点和1个可能的天冬氨酸富集区,但没有N-糖基化位点; (3)拟南芥类似晚期胚胎发生高丰度蛋白的LEA-2 结构域具有显著性 (E.Value司.30e七6人 为LEA蛋自基因家族ofam:LEA七)的一个新成员,但 152全长cDNA编码蛋白虽有2个LEA-2结构域,却不具显著性,152全长。DNA 是否属于LEA蛋白基因家族,目前尚难定论。LEA蛋白基因是一类在干旱和盐 胁迫下高丰度表达的基因,将大麦的LEA-2基因HVAI转入水稻,转基因水稻 植株的耐盐性得到了提高。 据此推论,152全长CDNA可能是一个与红树林植物海马齿耐盐相关的类 似于LEA-2蛋白基因的新基因。其功能鉴定及其它新基因差异片段全长CDNA 的克隆与功能鉴定有待下一步研究。


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