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假单胞菌YS1短链与中链PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因转化烟草的研究

郑军荣  
【摘要】: 聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHAs)是细菌细胞中的一种多聚物,可分为短链PHA、中链PHA及含短链与中链单体的PHA。由于它具有生物可降解性、生物相容性等特征,因而在医药、农业、环境及食品等领域有潜在的利用前景。 类产碱假单胞菌YS1(Pseudomonas psuedoalcaligeneseYS1)是一株能合成含短链与中链单体PHA的菌株。本研究利用聚合酶链式反应(PCR)技术,从P.psuedoalcaligenese YS1染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因:phaC1、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对phaC1基因进行了改造,经过基因拼接构建了带有卡那霉素抗性基因的植物表达载体pC3C1(嵌合phaC1)、pC3C2(嵌合phaC2)和pC3C1C2(嵌合phaC1和phaC2双基因)。将含有phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体pC3C1C2,用冻融法,构建了pC3C1C2根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHA105)的工程菌。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Honghuadajinyuan),利用100mg/L卡那霉素选择培养基诱导筛选出芽。2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株,抗性植株大田生长表型正常,生长速度相对缓慢。100株抗性植株经过PCR、PCR-Southern检测,初步确定有32%的烟草中稳定整合了phaC1和phaC2。利用卡那霉素抗性再筛选及Kan抗性大田直接筛选、Southern blot等方法对阳性植株作了进一步检测。用氯仿-次氯酸钠对32株PCR-Southern检测为阳性的转化植株中进行PHAs抽提,有25株中得到目的产物。提取物及新鲜转化植株叶片用傅立叶变换红外光谱进行定性检测,在1724cm~(-1)附近有特征吸收峰确定其为PHA,从而证实有25.00%的转基因植株已含有了目的产物。用气相色谱法对转基因植株中的PHA进行定性定量检测,确定PHA的主要成分为羟基癸酸(Hydroxydecanoate,HD),表达量最高为2.2%干重。


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