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香蕉果实炭疽病病程和病理生理生化及病程相关cDNA片段的克隆

张荣意  
【摘要】:果蔬的采后腐烂长期以来一直是一个全球性的问题。世界范围内果蔬采后贮运过程中约有25%的产品因腐烂变质而失去其商品或使用价值。尽管新鲜果蔬产品的品质恶化受诸多因素的影响,但真菌和细菌所导致的病害是最主要的原因(Eckert,1978)。发达国家有10%~30%的新鲜果品损失于采后的腐烂,在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家,其腐损率高达40%~50%(EI Ghaouth和Wilson,1995)。按腐烂比例计算经济损失,可以说是一个天文数字,此问题已引起世界范围极大关切,1974年在罗马世界食品会议上强调“应把减少作物采后损失作为增加食品供给的一项重要措施受到相应重视”(张维一,毕阳1996)。香蕉果实由于包装贮运不当、管理不善,缺乏防腐保鲜措施和设备,使香蕉在北运和出口中由于腐烂而造成的经济损失一般约为15%-30%。 香蕉果实炭疽病是一种典型的采后病害,进行此病的病程、分子检测及病程相关基因克隆的研究,对香蕉果实炭疽病针对性的防治、新的控制措施的开发和发现基因新功能,以及下一步的基因工程抗病育种奠定理论基础,同时对其他果蔬采后病害的研究提供借鉴。 研究开始于分离香蕉果实炭疽菌。采用组织分离法,从4~7成熟度的香蕉果实中分离到香蕉果实炭疽菌弱致病株Z_1、Z_2和强致病株Z_3、Z_4。研究发现强致病株和弱致病株的培养性质也存在明显的差别。 采用徒手切片法和石蜡切片法观察香蕉果实炭疽菌的侵染过程,接种在香蕉果实上的分生孢子6hr萌发,12hr形成淡色附着胞,24hr形成暗色附着胞,50d后未见附着胞形成侵入丝。暗色附着胞都潜伏在细胞间隙,并且一直潜伏到香蕉果实采收。 采用SDS法分别提取了香蕉组培苗基因组DNA、香蕉果实炭疽菌弱致病株Z_1基因组DNA。、香蕉果实炭疽菌强致病株Z_4基因组DNA、芒果炭疽菌基因组DNA、橡胶炭疽菌基因组DNA、柱花草炭疽菌基因组DNA、西瓜炭疽菌基因组DNA、香蕉冠腐病菌基因组DNA、西瓜枯萎病菌基因组DNA。以香蕉组培苗基因组DNA、香蕉果实炭疽菌强致病株Z_4基因组DNA、橡胶炭疽菌基因组DNA为模板进行RAPD分析,共筛选了40条随机引物,结果随机引物MQ8185的RAPD产生了差异条带。对差异条带进行回收、克隆和测序。差异片段序列登录到Genbank进行BLASTn分析,表明此差异片段为新报道的序列。 中国热带农业科学院华南热带农业大学2004届博士学位论文 以香蕉组培苗基因组DNA、香蕉果实炭疽菌强致病株Z;基因组DNA、橡 胶炭疽菌基因组DNA为模板进行Dot blottin乡结果都有杂交信号。根据 BLASTn的分析结果,又从此差.异片段中设计了357bP的探针,进行Southem blotting,结果只有香蕉果实炭疽菌强致病株z;基因组DNA产生了杂交信号, 香蕉组培苗基因组DNA和橡胶炭疽菌基因组DNA没有杂交信号,至此证明 357bP的片段为香蕉果实炭疽菌所特有的片段,可用于香蕉炭疽病的分子检测。 分子检测预试验结果表明:香蕉组培苗基因组DNA对香蕉炭疽菌基因组 DNA产生严重的干扰,当香蕉组培苗基因组DNA的用量为香蕉炭疽菌基因组 DNA用量的2倍和2倍以上时,目标带就检测不到。 对混合DNA进行酶切,用酶切后的产物作模板进行PCR检测,结果用EcoR I酶切后的产物作模板的PCR,,检测到了目标带,而用Pstl、Hindln的酶切 后的产物作模板的PCR,仍未检测到目标带。 香蕉果实接种后PCR分子检测试验结果表明:香蕉果实被高浓度的抱子悬 浮液接种后,检测到了目标带:但低浓度的抱子悬浮液接种香蕉果实后,仍未 检测到目标带。 采用Boller的方法对香蕉果实采收后的几丁质内切酶和外切酶的活性进行 了测定,结果无论是接种处理还是非接种处理,几丁质内切酶和外切酶的活性 都是逐天提高的,采收后第120hr达最大值。 采用SSH和Microarray相结合的技术方法,克隆到香蕉果实炭疽病病程发 展负调控基因和病程发展的正调控基因。 通过筛库获得了克隆136一5’端长约210Obp的片段。


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