新疆库尔勒香梨主要病毒的分子检测研究
【摘要】:我国果树主栽品种多数携带病毒。随着果树面积的不断扩大和栽培时间的延长,病毒的危害越来越明显,已引起广大科技人员重视,无病毒化生产是防治病毒病的主要措施。果树无毒化生产要求一种准确、灵敏、简便、快速的病毒检测方法,传统的木本指示植物检测,准确可靠,但耗时长;血清法检测常因抗血清制备难度大而价格昂贵。因此,为满足果树苗木检疫和无毒化生产的需要,摸索一种准确、灵敏、快速、简便的检测方法十分必要。近年来分子检测技术为果树病毒的检测提供了新的有力工具,使果树病毒的检测提高到了一个新水平。新疆的库尔勒香梨因其独特的风味品质而受到广大消费者的喜爱,是新疆出口创汇的主要产品之一。但近年来,发现新疆的香梨也普遍带有病毒,给新疆的香梨发展带来巨大的隐患,因此,开展新疆香梨病毒分子检测研究具有十分重要的理论和实际意义。
本研究主要包括库尔勒香梨主要病毒RT-PCR检测技术、多重RT-PCR检测技术、cDNA探针检测技术、原位RT-PCR检测技术等检测体系的建立和优化。
1.获得了适合于梨叶片及1—2年生枝皮层(可周年获得)的总RNA、dsRNA、总核酸提取方法,所提取的总RNA可很好地用于RT—PCR研究,所提取的总核酸可很好地用于核酸杂交试剂盒及RT—PCR试剂盒的周年检测。
2.根据ACLSV、ASPV、ASGV三种病毒基因组序列分别设计了相应引物,扩增出683bp、361bp、273bp保守特异性片断用于RT—PCR、NASH、ISRT—PCR检测。三个片段转入E. Coli并进行测序比较分析后,其核苷酸相似性分别为83.75%、79.5%和92.3%。三种病毒特异引物具有相同的退火温度等特点
可‘以使它们用于多重Rl,一PCR检测。
3.优化了香梨病毒的RT一PCR检测方法,结果表明,要获得良好的RT
一PCR扩增,RT体系中dNTPs浓度、互补引物、AMV的浓度要分别达到
0.1 75mmol/L、0.35林mol/L、0.5U单L以上;此外,使用RNasin能有效抑布ljRT
体系中RNase对病毒RNA的降解作用,可使RT过程顺利进行;PCR体系中
dNTPS浓度至少要达到0.15mmol/L,在 o.Zmmol/L可以获得最佳的扩增效果;
TaqE浓度要达到0.032u单L以上;引物浓度适宜范围0.2一1 .0件mol/L;Mg2+
要达到1.2一2,Ommol/I-。
4,利用1个来自苹果线粒体的NADH脱氢酶亚基5基因的2个外显子‘一扫
间隔1个内含子的结构,克隆了1个na亦基因的181bp片段,该片段跨越内
含子分别部分覆盖了2个外显子,经测序比较分析后,表明一该片断与原序列的
核营酸相似率为98.9%。利用该181bP片段建立了一个植物mRNA上的na内
用作内参照共同扩增的病毒RT一PCR检测体系,包括ACLSV、ASGV、ASPv
三种病毒的内参照共扩增多重RT一PCR检测系统及一步法RT一PCR。结果表
明,该na办内标非常有效地解决了常规RT一PCR中难以规避的假阴性问题。
三种病毒的多重扩增及一步法RT一PCR可使病毒的检测更加高效。
5.利用ACLSV、ASGV、AsPV特异引物合成了该3种病毒的生物素标
记cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究,
结果表明,当探针浓度为4oong/ml,甲酞胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可
获得最高灵敏度。进口硝酸纤维素膜的灵敏度最好,本底信号低。rp刃eenZo的
封闭效果比BSA好。针对常规核酸杂交过程长,操作复杂的问题,较大地改进
了杂交程序,使一个检测周期从22h缩减至sh。提高了病毒NASH检测效率。
6.组装了基于一步RT一PCR的内标控制检测试剂盒和基于生物素标记
cDNA探针的优化杂交检测试剂盒。用于2种试剂盒检测的病毒核酸样品通过
总核酸快速提取法获得,一步RT一PCR试剂盒使用了内标na石来严格控制假
阴性,生物素标记探针杂交检测试剂盒使用了优化的5h快速程序。实验结果
表明该试剂盒具有高效、快速、准确、稳定的优点。
7.用已知带有苹果褪绿叶斑病毒的香梨和无病毒实生苗叶一片为材料,利
用DIG标记,研究了香梨病毒的母t片石蜡切片IS一RT一PCR检测技术及茎尖
冰冻切片15一RT一pCR检测技术。包括Super Script 11逆转录酶、dNTps、RNasi;1
及互补引物浓度对cDNA合成的影响和退火温度、乙注TaqDNA聚合酶、Mg,十、
引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。研究结果表明:RNasin的用量
大于0.2U单L时,信号强度随着RNasin量的加大而增强;只有当dNTPs浓度
达一ommol/L时刁‘能生成一定量的eDNA;Superseriptll浓度在1.0一10U恤L
均可进行正常的逆转录,而且在该范围内产物的量随SuPer SeriPtH浓度提高而
增多;引物浓度达到0.9扒mol/L以上时刁‘能进行有效的逆转录,并且生成的
cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ACLSV的cDNA适合退火温度
为62oC。循环20一30次可出现较强的蓝色信号,引物浓度在0.8一1 .2林mol/L时显
色较好;LA Taq DNA聚合酶浓度为4u八00林L以上,均显示较深的蓝色;Mg2+
浓度为1.smmol/L就可满足原位PCR所需。并利用:TthDNA聚合酶在植物病
毒检测上实验了一步15一Rl’- PCR。获得了香梨病毒的原位PCR优化检测体系。
结果表明病毒在香梨叶片的栅栏组织及0.2cm茎尖的皮层外围细胞、初生维管
束中滴度较高。
|
|
|
|
1 |
徐庆岫,覃伟铭,李春江,翟林涛,魁丹;库尔勒香梨产生粗皮果的原因分析[J];落叶果树;2002年01期 |
2 |
闫玉兰;;酒泉市库尔勒香梨高接管理栽培技术[J];甘肃农业科技;2008年06期 |
3 |
谢永娟;童军茂;王洪新;陈国刚;魏长庆;;用超声波法提取库尔勒香梨中果胶成分的研究[J];农产品加工;2009年06期 |
4 |
倪座山;张秋波;李林;;提高库尔勒香梨品质的技术途径[J];落叶果树;2009年06期 |
5 |
刘国营;;库尔勒香梨采收后管理技术要点[J];落叶果树;2011年02期 |
6 |
何子顺;阿衣木古丽·乌布力;杨庆礼;张衍云;;库尔勒香梨授粉受精影响的因素与对策[J];果树实用技术与信息;2011年06期 |
7 |
张倩;李新建;吉春容;吴新国;;库尔勒香梨盛花期预报模型初探[J];山西农业科学;2012年11期 |
8 |
周志雄,周光文,张兴发,王蔚,杨品亮,雯茜姆;库尔勒香梨对离子空气的感应性[J];园艺学报;1980年02期 |
9 |
郭文场;库尔勒香梨[J];特种经济动植物;1999年06期 |
10 |
王志军,邓慧君;提高库尔勒香梨商品率的若干技术探讨[J];新疆农垦科技;1999年05期 |
11 |
蒋鑫;库尔勒香梨产业化孕育养蜂商机[J];蜜蜂杂志;2000年09期 |
12 |
成磊,梁玉;绿色食品库尔勒香梨栽培技术[J];新疆农垦科技;2000年06期 |
13 |
陈卫东;库尔勒香梨栽培中存在的三个问题[J];新疆林业;2000年06期 |
14 |
冯永延;;发挥地缘优势,加快发展库尔勒香梨产业[J];农村科技;2000年06期 |
15 |
王大伟,张琦,向延菊;塑料套袋对新疆库尔勒香梨果实品质影响[J];北方园艺;2001年06期 |
16 |
张琦;套袋对库尔勒香梨果实品质的影响[J];北方果树;2001年05期 |
17 |
何晓霞,覃伟铭,谭秀珍,肖飞,衡永忠;库尔勒香梨园生产管理及害虫防治[J];果农之友;2001年05期 |
18 |
努尔斯曼;发展库尔勒香梨产业的探讨[J];新疆农业科技;2001年04期 |
19 |
许咏梅,付明鑫,覃本民,翟林涛;新疆库尔勒香梨氮磷钾适宜用量研究初报[J];新疆农业科学;2001年05期 |
20 |
苏柳芸
,井春芝
,李林
,王允栋;库尔勒香梨无公害栽培技术[J];中国果树;2003年04期 |
|