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结核DNA疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究

朱中元  
【摘要】:结核病仍对人类健康构成重要威胁。全球现有TB患者近3000万,每年病死数近300万。结核病唯一可用的免疫预防制剂是BCG。它的免疫保护力介于0-80%之间,WHO的调查研究表明其保护力也仅为50%。成年人及老年人并不能得到BCG的有效保护。BCG对热敏感,在运输、贮存中需要低温保存。因此寻找新型高效,效果稳定的疫苗一直是相关领域研究人员关注的热点。 本研究的目的,是设计和构建真核表达结核菌蛋白的载体即DNA疫苗,并对其免疫功能及保护力进行研究。所设计构建的10种结核DNA疫苗依次为TB-V1,表达结核菌Mtb8.4;TB-V2,表达结核菌Ag85B蛋白;TB-V3,表达Mtb8.4、38kDa的Th表位和CTL表位以及Ag85B的融合蛋白;TB-V4,表达GST和Mtb8.4的融合蛋白;TB-V5,表达GST与Ag85B的融合蛋白;TB-V6,表达含hIL-2信号肽的Mtb8.4;TB-V7,表达含信号肽的Ag85B;TB-V8,表达含信号肽的Mtb8.4、38kDa蛋白的CTL/Th表位以及Ag85B成熟蛋白的融合蛋白;TB-V9,表达信号肽的Mtb8.4与GST的融合蛋白;TB-V10,表达含信号肽的Ag85B与GST的融合蛋白。TB-V6-TB-V10等5种载体,均在表达结核蛋白的N末端插入hIL-2的信号肽。p-hIL2质粒表达hIL-2;p-hIL2s质粒仅表达hIL-2的信号肽,作为对照。 所构建的12种质粒DNA,经PCR、酶谱鉴定后,并对插入表达目的的DNA片段进行了测序分析,表明所构建的12种载体质粒与构建设计准确无误。 p-hIL2、p-IL2s、TB-V6、TB-V7、TB-V8、TB-V9与TB-V10质粒DNA,以0.1M PBS将其分别稀释成1mg/mL溶液,除菌,然后分别在0d、15d和30d,分3次在8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠四肢肌肉各注射0.1mL(100 μg/只小鼠)。对照组为等剂量的pVAX1、D-IL2s、PBS溶液。阳性对照组为BCG,以10~5CFU注射小鼠皮内,与其他小鼠初免时一同免疫,该组每只小鼠只免疫1次。疫苗免疫组、对照组共12组,分别是TB-V6~TB-V10等5组,p-IL2质粒注射组,TB-V6+p-hIL2 2作者:华南热带农业大学博士研究生朱中元,导师:张春发 和TB一7+,hILZ联合免疫2组(每种质粒各50 ug免疫),PBs,BcG, pVAXI和尸LZs共4个对照组。每组10只小鼠。 在最后一次DNA疫苗加强免疫15天后,杀死每组的其中5只小鼠, 取脾磨成匀浆,并用10%FCS RPMll64O培养基将脾淋巴细胞配成10V mL浓度,加入到24孔培养板中,200 pl吼,5%Cq条件下培养72h, 上清经ELIsA法测定鼠白细胞介素一(mIL一2)、而L-6、而L一10和鼠7 干扰素(mIFN斗)。处死小鼠时采血,用于测定hIL一2。 在DNA疫苗最后一次加强免疫的21天,将结核菌H37RLv株培养约 20天的细菌磨成悬液,取106/0.llnL菌经尾静脉注射实验感染每组剩下 的5只小鼠。感染15天后,杀死所有小鼠,取脾、肝和肺分别称重,制 成匀浆,接种0.lmL于改良罗氏培养基(L一)培养瓶,置37C培养20一30 天,计数。并根据器官重量和稀释倍数,换算出每种器官培养物的 CFUlg。每个小鼠的每种器官各接种3支L一培养,取其均数作为最后 结果。 检测各免疫组、对照组的上清中的而L一2,而L一6,而L一10和 而FN斗以及血清中hIL一2的含量,显示TB一v6,TB一V7,TB一vs, TB一vg,TB一V10,TB一v6+P扣L2,TB一v7+p扣L2及p一hILZ等8个免疫 组的mIFN斗及mIL一显著高于pVAXI,PBs和p一LZs质粒对照组,与 BCG免疫组的水平稍低或相当。其中p.hiLZ注射组,TB一v6+p-hiLZ 以及犯一7+p一址LZ联合免疫组小鼠血清hIL一2水平显著升高。而这8组 的体外淋巴细胞培养上清中的nilL一6及mIL一10的含量不升高或升高不 明显。表明犯J6~TB一vlo等5种DNA疫苗及p扣LZ表达载体能够刺 激预防结核病所需的几1型免疫应答。 TB一6~TB一V10等5种疫苗免疫的5只小鼠的脾结核菌载量分别为 44 1 68、28400、1 8597、34703和22954CFIJ/g。TB一v6+P一LZ和 TB一V7+P一L2联合免疫组和p一hILZ注射组的脾结核菌载量分别为 12471、34x57和51339 CFU/g。对照组邓S、pVAXI、p一LZs及BCG 的脾细胞悬液的结核菌计数结果均数分别是:61012、60716、69395 和1 1 164CFU/g。表明本研究中构建的,IB一6~TB一v10等疫苗具有减少 免疫鼠经H37Rv攻击后脾脏结核菌载量,且TB一vs疫苗,TB一v6+P一砚 联合免疫,产生的保护力与BCG免疫产生的保护力非常接近。为进一 步研究这些疫苗防止大动物感染结核菌H37Rv的实验研究奠定了基 础。 我们在结核DNA疫苗的构建设计中使用了hIL一2信号肤序列,并采 用表达hIL.2的质粒与TB DNA疫苗联合免疫及构建表达融合蛋白 (GST)的疫苗,并获得与BCG非常接近的保护力。均为TB DNA疫 结核D队疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究」 苗研究首次报道。取得了预期的研究结果,对其他疫苗的研究有指导 参考价值。 结论: 1.所构建的表达结核菌蛋白或融合蛋白的载体:邓一1、TB一2、 TB~V3、TB.V4、TB~VS、TB一V6、TB~V7、TB一VS、TB一Vg、TB一V10、 表达bIL.2的载体卜拍LZ和表达hiL一2信号肤的载体尸LZs等经抗性筛 选、酶谱鉴定及DNA序列分析,结果表明12种DNA疫苗表达载体质粒 的构建均与设计要求准确无误。 2.TB一6、TB一V7、TB一7、TB一VS、TB一Vg与TB一V105种DNA疫苗 单独免疫,或者


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10 ;疫苗[J];生物技术通报;1989年03期
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12 ;疫苗[J];生物技术通报;1996年01期
13 胡少昶;群体免疫力的概念[J];国外畜牧学.猪与禽;1999年01期
14 谢建平,乐军,王洪海;后基因组时代的结核新疫苗研究[J];生命科学;2002年01期
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16 张灵霞,庄玉辉,何秀云,张晓刚,李国利;16S~23SrDNA间隔区序列在分枝杆菌分类鉴定中的应用研究[J];微生物学报;2000年05期
17 Chadwick WV;分枝杆菌(续二)[J];微生物学免疫学进展;1986年01期
18 李元,李别虎,白光春,范雄林,薛莹,贾向志,庄玉辉;改良消减杂交法筛选结核分枝杆菌毒力相关基因[J];第四军医大学学报;2000年07期
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