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烟草抑芽基因克隆及遗传转化研究

陈兴江  
【摘要】:优质烤烟种植过程中,打顶抹芽是一项重要的生产技术措施,烟草在一定的生长时期必须打顶,而打顶后会萌生大量的侧芽。侧芽耗费营养,会降低烟叶的商业价值,因此必须抹掉侧芽。打顶加人工抹芽耗费劳力过大,提高了烟叶生产成本。打顶后施用抹芽丹可抑制腋芽生长,降低烟叶生产劳动强度,但仍解决不了烟叶生产成本增加问题,并且因为抹芽丹属于化学制剂,会造成环境污染。而用基因工程方法创造打顶后可自行抑制腋芽的烟草品种则可能从根本上解决上述问题。 对拟南芥突变体sps的研究发现,SPS基因有抑制侧芽生长的作用;通过反义技术抑制烟草NtPSA基因表达,得到了灌丛状的转基因植株,推测该基因有抑制侧芽生长的作用;另外,豌豆的PsAD1基因也有抑制侧芽生长的作用。 在转基因植物中如使用组成型启动子,会使目的基因稳定而持续表达,过度消耗细胞内的物质和能量,而使用诱导型启动子只有在接受诱导信号后,目的基因才会表达,且胁迫解除后目的基因停止表达,不会对植物的其他生理活动造成很大影响。 我们克隆了SPS、NtPSA和PsAD1三个抑制侧芽生长的基因,连接到载体pBI121上,然后用伤诱导启动子POD替换了pBI121载体上的CaMV35S启动子,构建了三个植物表达载体。另外,为了剔除标记基因,还构建了一个双元双右边界载体系统。 研究发现番茄LS基因、拟南芥LAS基因、水稻MOC基因都有启动侧芽生长的作用,三个基因都属于GRAS基因家族成员,DNA序列和氨基酸序列比对结果显示,他们拥有几段相同的氨基酸序列。我们根据这三个基因共有的氨基酸序列设计简并引物,同源克隆了烟草侧芽发生关键基因(命名为TLS基因)的一段cDNA序列,BLSAT分析结果表明,TLS基因与GRAS基因家族有较高的氨基酸同源序列,说明该基因在烟草中可能调控侧芽的起始;RT-PCR显示,TLS基因在顶芽、侧芽、根部、花芽等部位都有表达;最后将该片断亚克隆到pKANIBAL载体上,构建了RNA干扰载体。 用叶盘转化法将三个带有伤诱导启动子的植物表达载体转化烟草,随机抽取几株转基因再生苗,PCR结果显示抑芽基因己成功导入到烟草中;但是用RNA干扰载体转化烟草没有得到转基因再生苗,在农杆菌侵染过的叶片上长出的愈伤组织在抗性培养基上慢慢褐化,不能长成不定芽,分析结果表明可能TLS基因表达被抑制导致了这一结果。


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