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水稻白叶枯病菌致病性功能基因组学分析

黄贵修  
【摘要】:革兰氏阴性菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病是水稻(Oryza sativa L.)生产上最严重的细菌性病害,它也是研究植物——病原互作的重要模式菌。为研究Xoo致病分子机制,开展致病基因功能基因组学分析,我们用近年来广为使用的“鸟枪法”(shotgun)测序策略对PR6菌株基因组全序列进行测定。构建三套高质量基因组文库,用小片段文库进行大规模序列测定。迄今己完成21211 reads测序工作,测序总长度达16459736 bp,约3.3倍基因组序列覆盖率。序列经初步组装获得529个Contigs,长度达4.94 Mb,得到了PR6菌株基因组全序列基本框架。组装序列分析发现,框架序列中能找到4555个(98.23%)编码蛋白基因序列与Xoo KACC 10331菌株序列高度同源。这为进一步确定和分离Xoo致病基因及其功能基因组学分析奠定了基础。 通过致病性分析,从17184个Tn5转座子插入突变体库中筛选到在水稻感病品种IR24上致病性明显下降或完全丧失的突变体332个。对其中的112个突变体Southern blot分析表明,有105个突变体(93.76%)的转座子在基因组上为单拷贝插入。在PSA培养基上,大多数致病性相关突变体的培养特征与野生型相同,能正常分泌胞外酶。通过TAIL-PCR分离的转座子侧翼片断属于46个基因,还有14个突变体的插入位点位于内源转座子或启动子上或基因间。41个已经确定功能的基因中与分泌系统有关的超过三分之一(15个),说明分泌系统对致病性有重要作用。其它主要是一些与胞外多糖、脂多糖合成有关及与细菌基础代谢和基因调节相关的基因。 有15个突变体的转座子插入位点分别位于Ⅱ型分泌系统xps基因簇的6个基因上,PCR、Southern blot证实突变体确为转座子插入引起。突变体生长培养特征、胞外多糖分泌与野生型无明显差异,但胞外酶不能有效分泌。通过测序和PCR方法得到11037 bp的xps基因簇全长序列,并克隆了其中的6个xps基因;序列同源性分析发现,PR6菌株的xps基因簇与其它病原黄单胞菌小种的序列同源性很高。初步的xps基因簇的SDS-PAGE、RT-PCR和Western blot分析发现,xps基因除共同启动子外,基因内可能还存在一些各自的启动子;突变体中至少有两种蛋白在胞间周质累积,其中有一种蛋白可能编码木聚糖酶。 在112个致病性相关突变体中,发现有一转座子插入到编码芳香族氨基酸代谢途径DAHP合成酶基因(aroG基因)上的突变株。突变株在感病水稻品种IR24上的生


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