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拟青霉E7蛋白酶基因克隆表达及产酶条件研究

蒋桂芳  
【摘要】: 拟青霉E7是本实验室从土壤中筛选出能产蛋白酶的一株菌株,其发酵液具有明显的杀线虫活性。本文以E7菌株为出发菌株,进行了产酶发酵条件优化和蛋白酶部分酶学性质的研究;并对编码该蛋白酶的功能基因进行了克隆和表达初步研究。 产蛋白酶的最佳培养基组成:2%大豆粉、2%麦麸、1%NH4NO3、0.5%蛋白胨、0.01 %CaCl2、0.4%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、pH7.0。而最佳发酵条件是按1%接种量接种于上述发酵培养基(培养基与容器体积比为1:5~1:7)中,在28℃、180rpm培养中振荡培养72h,经测定发酵液中蛋白酶活力可达到465U/ml左右。 粗酶液在40℃保温2h,酶活力未见明显下降,但热稳定性较差,60℃保温1h后,基本已检测不到酶活;在pH8~11的范围内E7蛋白酶酶活保持稳定。菌株E7分泌蛋白酶的最适温度40℃,最适酶作用pH10.5。 以菌株E7的总cDNA为模板,根据已报道的PL基因及多个微生物蛋白酶基因序列设计引物,克隆出拟青霉蛋白酶的保守序列500bp,序列测定结果表明与已报道PL基因序列100%的同源性。在此基础上,重新设计特异引物PCR扩增出约850bp的成熟肽,命名为PL基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后以正确阅读框架定向克隆于经同样双酶切的pET-22b(+),转化表达宿主菌BL21(DE3),该菌株经IPTG诱导可表达分子量约31kD的特异蛋白,定量分析表达的目的蛋白为总蛋白的60%。 将表达的PL蛋白切胶回收,研磨成粉后加入等体积的福氏不完全佐剂,乳化制备成抗原。免疫家兔四次后,采血收集抗血清,用ELIA测定效价为1/10000。


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