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合成启动子及CBF异位表达对转基因烟草生长发育的影响

崔百明  
【摘要】: 环境胁迫(干旱、低温和盐)是影响植物和造成重要农作物严重减产的主要自然灾害。许多植物经过低温锻炼后可显著提高抗冻性,即冷驯化。冷驯化过程中,大量基因被诱导表达,这些基因中有许多的启动子区含有CRT/DRE顺式作用元件。业已证明,冷响应转录激活因子CBF是植物冷驯化的关键调节因子,CBF特异地与CRT/DRE相互作用从而诱导含有该元件的抗逆基因表达。在转基因植物中过量表达CBF可以在通常生长条件下,激活许多抗逆相关基因的表达并显著提高植物的抗旱、抗盐和抗冻能力。但高水平表达CBF,例如使用组成型强启动子CaMV 35S启动子,往往导致转基因植物生长发育严重受阻,影响其在作物抗逆基因工程中的应用。使用胁迫诱导型启动子rd29A,使CBF只在胁迫诱导时表达,则既减小了对植物生长的影响,又获得了甚至比使用35S启动子更好的抗逆效果。我们设想,用化学诱导型启动子控制CBF的表达,将可以更好地解决过量表达CBF引起的植物生长发育迟滞问题,并使CBF只在需要时表达。 有本研究利用植物防御基因中的病原诱导响应元件和最小35S启动子(-62~+1),人工合成了2个启动子——C2W和SAR,并以GUS基因为报告基因,在转基因拟南芥中分析了合成启动子的表达特性。分别用C2W启动子和35S启动子与拟南芥CBF1、CBF3基因以及小拟南芥COR15a基因表达框架组合构建了6个植物表达载体,并转化烟草。通过调查异位表达CBF的转基因烟草的生长发育,研究探讨了CBF影响植物生长发育的原因。结果如下: 1. SAR启动子具有组织和发育表达特异性:对转基因拟南芥GUS组织染色的分析表明,SAR启动子在子叶、毛刺、根茎交接处和根系中优势表达,在老叶中的表达量高于幼叶中的。 2. C2W和SAR启动子均响应机械损伤的诱导。 3.过量表达AtCBF1(35S:: AtCBF1)严重影响转基因烟草的生长发育:植株矮化、去顶端优势化、叶片畸形、早衰、开花延迟或不育。 4.使用合成启动子C2W的AtCBF1转基因烟草,在外观形态上与野生型无明显区别。说明,在正常条件下,合成启动子C2W本底表达水平较低。半定量RT-PCR分析结果表明,AtCBF1的转录表达受水杨酸的诱导,2mM水杨酸可获得最大的诱导效果。10mM以上水杨酸对烟草有损害。


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