红树植物内生放线菌的分离鉴定和2株海洋链霉菌活性代谢产物的分离鉴定

【摘要】： 本研究以红树林植物为研究材料,分离红树植物内生放线菌,并在菌株鉴定基础上,对其细胞毒活性、抗菌活性进行评价,为红树植物内生放线菌资源的开发和利用提供依据。 通过乙醇、氯化汞对样品进行表面消毒,选用1/10ATCC172培养基,结合放线菌酮、制霉菌素、甲氧苄氨嘧啶、新生霉素等抗生素作为选择培养方法,对内生放线菌进行选择性分离。从来自海南清澜港红树林保护区的18种红树植物3种半红树植物样品中,分离到139株内生放线菌。内生放线菌在不同红树植物中的分布存在差异。 对分离到的139株菌通过菌落形态、培养特征、细胞壁氨基酸、全糖分析和16S rDNA序列分析,分类鉴定到属。本研究分离到的139株内生放线菌共分为2个属,分别是小单孢菌(Micromonospora)和链霉菌属(Streptomyces)。本研究所选择的分离方法获得的内生放线菌,小单孢菌占绝对优势。 采用MTT法和美蓝酶标仪法对所分离到的内生放线菌进行体外细胞毒活性和抗菌活性检测,共有45株菌显示对肝癌SMMC-7721细胞有细胞毒活性,占总菌株数的32.3%。共分离到抗MRSA活性菌株31株,占总菌株数的22.3 %。所有测试菌株均未检测到抗白色念珠菌活性。 我们研究证实红树植物内生放线菌,作为一种新颖的微生物资源,有着很大的研究开发潜力。 通过对菌株0616208和124092的细胞毒活性的遗传稳定性分析,其中菌株124092的ID_(50)保持在5120,菌株0616208的ID_(50)也在480左右,发现它们都具有较好的遗传稳定性。对2株具有细胞毒活性的放线菌的来源性进行分析,结果表明: 2株菌株均在纯海水配制的YE平板上比在纯蒸馏水配制的YE平板上生长较好,并且都有一定的耐盐性,菌株0616208对NaCl的最高耐受性在13～15%,菌株124092对NaCl的最高耐受性在10～13%,所以它们很可能是来源于海洋的微生物。 应用形态学、化学和分子生物学方法,对两株放线菌进行多相分类鉴定。结果表明,菌株0616208与已知菌株Streptomyces cinerochromogenes strain: NBRC 13822(AB184507)最为接近,但它们的相似性只有96 %,为一新种。菌株124092和Streptomyces parvus strain: NBRC 3388(AB184756)的16S rDNA序列同源性很高,相似性达99%,但结合其形态特征分析、生理生化特征分析与细胞壁化学分析,结果显示菌株124092与Streptomyces parvus最为相似。结合其更适于海洋环境生长的特性,暂将其定为小链霉菌海洋变种(Streptomyces parvus var. marinus)。 本文对菌株0616208和124092的代谢产物进行了研究,综合运用VLC、硅胶柱层析、Sephadex-L20凝胶柱层析等分离纯化方法结合TLC检测,从两株菌中共成功分离鉴定7个化合物的结构,其中3个为新化合物,经各种波谱数据分别鉴定为:p-tolyl-3-aminopropanoate);6-amino-3-(4-hydroxybenzyl)-1,4-diazonane-2,5-dione;(1α, 4aα, 5α, 7β, 8aβ)-5, 8a-dimethyldecahydronaphthalene-1, 4a, 7-triol。其余4个为己知化合物,分别为:正丁基-α-D-吡喃甘露糖苷、~1H-3-吲哚甲酸、7, 4'-二羟基异黄酮(7 , 4'-dihydroxyisoflavone)和尿嘧啶。 对从菌株0616208和124092中分离到的7个化合物进行了细胞毒活性的检测,发现除1H-3-吲哚甲酸和尿嘧啶外,其他5个化合物都有细胞毒活性,但活性不一。具有进一步研究价值。 本文的研究结果表明,海洋红树林放线菌确是一类值得更好地开发的放线菌资源,是新颖结构和新生物活性的次级代谢产物的一个重要来源。