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壳聚糖及其衍生物脱除牡蛎中麻痹性贝类毒素的研究

刘晓丽  
【摘要】:近江牡蛎(Ostrea Rivularis Could)是我国沿海主要的贝类养殖品种。麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)广泛影响公共健康和安全,在世界范围内引起了严重的经济损失,它的主要来源是能够产生毒素的亚历山大藻类,然后通过食物链的关系传递给贝类和人类,从而影响人类健康,在很多地区,包括中国都有发现。壳聚糖(Chitosan)及其衍生物(derivatives)是一些高分子化合物,高分子链中含有-NH2和-OH活性基团,能与重金属离子等形成配位化合物,可做为吸附剂,用来脱除重金属等,而且无毒、不产生二次污染,并能被微生物作用分解。本文通过从微小亚历山大藻中提取出PSP,并用壳聚糖及其衍生物(CTSD)对其进行吸附研究;通过对毒素在牡蛎体内蓄积模型的建立,将CTSD应用到牡蛎体内PSP的脱除研究中。具体可以得到以下结论: (1)在实验室对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)进行了培养,并对它们的生长条件进行了优化,筛选出了微小亚历山大藻作为产麻痹性贝类毒素的最终来源藻。首先通过接种对数生长期藻细胞,培养8天内就能达到最高细胞密度(2.0×10~4 cells/mL)左右,再以0.05mol/L的乙酸超声波破碎藻细胞提取粗毒素,结合小白鼠生物检测法,经高效液相色谱分析,本株藻主要含有GTX1、GTX2、GTX3和GTX4,浓度分别为GTX4 (5.04)GTX3(4.97)GTX1(2.14)GTX2(2.08)(单位:fmol/cell),毒素粗提液经过Sephadex-G15凝胶层析柱处理,用小白鼠生物法和荧光分光光度法联合检测定位,收集到纯度较高的PSP,本章工作为将来贝类毒素的研究提供原料。 (2)用CTSD吸附PSP,在单因素如pH值、反应时间、温度和CTSD添加量的基础上,研究了吸附动力学,通过将动力学数据用动力学一级反应方程和动力学二级反应方程模型来拟合,结果证明更符合动力学二级反应方程模型,说明化学吸附过程是受速度限制的过程。将热力学数据用热力学模型拟合后,发现与Freundlich热力学模型能够很好的符合,并且通过Van’t Hoff方程,得到了吉布斯自由能(△Go)、焓变(△H~o)和熵变(△S~o)。它们的值△G~o0、△H~o0、△S~o0说明反应过程是自发的和吸热的过程。 (3)采用实验室培养的方法,研究了在投喂有毒微小亚历山大藻的情况下,微小亚历山大藻所产PSP在近江牡蛎体内蓄积、排出的规律。实验分为蓄积和排出两个部分,蓄积实验设计了三个投喂浓度:A组为4.0×10~3 cell/mL、B组为8.0×10~3cell/mL、C组为1.2×10~4cell/mL,实验结果表明,随着微小亚历山大藻密度的提高,PSP在近江牡蛎体内的蓄积速度会越来越快。A组、B组、C组的最高蓄积量依次为5692 MU、6503 MU和8193 MU,最终蓄积量分别超过了国家限量标准的14.23、16.26、20.48倍。 (4)在以上研究的基础上,对B组的牡蛎采用活体排毒素研究,研究发现在养殖过程中投放0.05 g/L的壳聚糖或衍生物和无毒的小球藻,对促进牡蛎体内毒素的排出有较大作用,初始PSP含量为6503 MU的牡蛎,经过15天的脱除后,PSP含量下降到93.33 MU。通过采用死体脱毒的方法,使用本研究制备的壳聚糖微球(用乙酸溶解后,再用戊二醛和甲醛交联)对其进行脱除,研究发现壳聚糖微球对毒素有很好的脱除效果。而且采用壳聚糖微球对牡蛎肉浆中的毒素进行脱除时,牡蛎肉浆不需调pH值即可达到很好的脱除效果,对牡蛎肉浆中毒素的脱除率可达90%以上。 (5)对脱毒后的牡蛎肉进行了深加工,为了得到风味良好的牡蛎酶解液,将新鲜的近江牡蛎肉经木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解,采用固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)联用法分析、鉴定了牡蛎肉原料和酶解液的挥发性风味成分,探讨了酶解对牡蛎风味的影响。经NIST质谱数据库检索和文献对照,三个样品分别检出57、60和62种成分,主要有烃类、醇类、醛类、酮类和含硫化合物等,它们的协同作用构成了牡蛎及其酶解液的特征气味。其中牡蛎肉含有较多的酮类化合物,而酶解后则含有较多的醛类和脂类化合物,三个样品中均检出了较多的醇类化合物,归一化含量分别高达40.24%、41.20%和43.28%,中性蛋白酶制备的酶解液比木瓜蛋白酶制备的酶解液风味更加柔和。结果表明,酶解反应能够保持并改善牡蛎的风味,所制备的酶解液具有较好的应用前景。


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