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近江牡蛎糖胺聚糖免疫调节作用及体外抗肿瘤活性的研究

刘倩  
【摘要】:目的: 本文以近江牡蛎全脏器为实验原料,通过酶解法提取近江牡蛎糖胺聚糖(Crassostrea Rivularis glycosaminoglycan),对其理化性质和免疫调节作用、体外抗肿瘤活性进行研究。 方法: 采用柱层析法分离纯化近江牡蛎糖胺聚糖得到纯化级分;用高效液相色谱(HPLC)法、红外光谱(IR)法分析其理化性质;采用小鼠体内注射环磷酰胺(CTX)法建立免疫抑制动物模型以及细胞实验,分析近江牡蛎糖胺聚糖对小鼠的非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫和NK细胞活性的影响;采用ELISA法检测肿瘤坏死因子TNF-α、干扰素IFN-γ、小鼠白细胞介素IL-2的含量;同时测定近江牡蛎糖胺聚糖体外对K562、CNE-2Z、Hela细胞生长的影响。 结果: 1.对酶解法提取得到的近江牡蛎糖胺聚糖粗提物(PCG)进行等电点除蛋白和超滤脱盐浓缩,得到精制品(CG),经DEAE-52纤维素柱分离得到组分CGI和CGII。对CGI和CGII分别过Sephadex G-200凝胶柱,得到组分CGIa和CGIIa。经分析,CGIa是由糖醛酸:氨基葡萄糖=1:1.38的比例构成,硫酸基含量为20.62%,相对分子量5.17×10~5Da;CGIIa是由糖醛酸:氨基葡萄糖=1:1.58的比例构成,硫酸基含量为18.49%,相对分子量为2.64×10~5Da。红外光谱分析显示,CGIa和CGIIa都具有糖胺聚糖的特征吸收,CGIIa具有α糖苷键。 2.近江牡蛎糖胺聚糖对免疫功能的调节作用结果: (1)对小鼠免疫器官的影响:在体外免疫抑制模型中,50mg/kg和100mg/kg的CG可以显著增强正常小鼠的脾指数和胸腺指数(P﹤0.05, P﹤0.01);并对CTX造成的免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数具有修复作用,效果显著(P﹤0.05,P﹤0.01)。 (2)对小鼠细胞免疫的影响: CG,CGIa,CGIIa(10μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)均能促进和协同ConA促进小鼠脾淋巴细胞的增值,其中25μg/ml的CGIa剂量组的刺激系数最高,达到1.44。CG、CGIa和CGIIa协同ConA刺激脾淋巴细胞的增值效果体现出了与CG、CGIa、CGIIa直接作用于脾淋巴细胞的增持效果相同的趋势,其相关性较强。 (3)对小鼠单核巨噬细胞的影响:CGIa和CGIIa(10μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)均能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力(P﹤0.05或P﹤0.01);25mg/kg和50mg/kg剂量的CG对小鼠廓清指数有显著增强作用(P﹤0.05)。 (4)对小鼠抗体生成细胞数和血清溶血素的影响:CG(25mg/kg,50mg/kg,100mg/kg)抗体生成数与生理盐水对照组均有极显著差异(P﹤0.01),对CTX模型组的治疗效果极其显著(P﹤0.001);CG(50mg/kg,100mg/kg)的小鼠血清溶血素含量与生理盐水对照组有极显著差异(P﹤0.01),CG(25mg/kg,50mg/kg,100mg/kg)能够提高CTX模型组的血清溶血素水平(P﹤0.05或P﹤0.01)。 (5)对NK细胞的影响:CG、CGIa、CGIIa的四个剂量组(10μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)均能增强NK细胞的杀伤活性(P﹤0.05或P﹤0.01),存在一定的量效关系。100μg/mL的CGIa杀伤活性最高,达到39.09%。 (6)细胞因子实验结果:CGIa和CGIIa(25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)均能促进小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和NO(P﹤0.05或P﹤0.01);CGIa和CGIIa(25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)能够促进小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-2(P﹤0.05或P﹤0.01)和IFN-γ(P﹤0.01);TNF-α、IFN-γ、IL-2的最大产生量分别为912.941pg/mg,651.579pg/mg,2.821pg/mg。 3.体外肿瘤抑制实验:CG,CGIa和CGIIa(10μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL)对K562、CNE-2Z、Hela细胞的生长均具有抑制作用,与5-Fu合用可以增敏抗肿瘤药效。 结论: (1)近江牡蛎糖胺聚糖的纯化级分CGIa和CGIIa的相对分子量分别为5.17×105Da和2.64×105Da,经化学法分析和红外光谱分析都是糖胺聚糖。 (2)近江牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠免疫器官指数、细胞免疫的影响、单核巨噬细胞影响、抗体生成数和血清溶血素影响、NK细胞的杀伤活性均为阳性,表明其具有免疫增强功能。免疫功能的增强可能是通过促进细胞因子的分泌实现的。 (3)近江牡蛎糖胺聚糖在体外直接作用于肿瘤细胞K562、CNE-2Z和Hela,一定程度地抑制其生长,并能够与5-Fu联用来增强抑制肿瘤细胞生长的效果;根据近江牡蛎糖胺聚糖对体外培养肿瘤细胞的作用结果并结合3.4.2.1实验结果初步判断,近江牡蛎糖胺聚糖能够直接作用于肿瘤细胞,而对正常细胞无杀伤作用。


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