湛江红树林滩涂海洋细菌多样性的研究

【摘要】：红树林是分布于热带、亚热带海岸潮间带，以红树植物为主的一种木生植物群落，是陆地向海洋过渡的特殊生态系统。由于其生长环境独特，成为很多生物的栖息场所，蕴藏着丰富的并极具特色的微生物资源。滩涂海洋细菌更是红树林微生物的重要组成部分。本实验于2010年9月对湛江高桥红树林保护区进行采样，旨在明确高桥红树林滩涂海洋细菌的种类和群落结构变化。实验按照不同的潮位带（低、中、高）和不同土层（0~5cm、20～30cm）采集滩涂土壤样品30份。运用微生物分离培养技术测定土壤可培养细菌的个体数量，并对部分海洋细菌进行鉴定；应用PCR-DGGE技术对滩涂海洋细菌16S rDNA片段的V3区进行多样性分析；分析土壤含水量、pH值、N、P、K含量和重金属含量等对土壤细菌群落的影响。主要得到如下结果： 1.采用稀释涂布平板法测定土壤样品中细菌个体的数量为中潮位带高潮位带低潮位带，依次为1.76×10~7、1.65×10~7、1.51×10~7cfu/g.fw。采用纯培养法从三个潮位带的样品中一共分离得到90株纯培养细菌菌株。选择14株具有代表性的菌株进行系统发育分析，结果表明14株分离菌株代表11个物种，分布在2个细菌类群中：厚壁菌门（Firmacutes）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria），其中最优势群落为芽孢杆菌属（Bacillus71.4%） 2.对30份红树林滩涂土壤样品总DNA扩增的16S rDNA V3片段进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）。利用Quantity-One软件分析DGGE图谱中的条带数量及灰度，研究样品中的细菌丰富度指数（S）、多样性指数（H），均匀度（EH）等。结果显示：高桥红树林30个土壤样品中细菌群落的丰富度、多样性指数、和均匀度等指标均存在差异；且土壤样品的细菌丰富度和多样性指数均呈现出表层土样深层土样，中潮位带高潮位带低潮位带的趋势。 3.根据红树林土壤各样品的DGGE图谱，对较亮的优势条带和差异性较大的条带进行切胶回收，进行克隆测序后得到61个条带的序列。将序列提交到GenBank，通过BLAST与数据库中序列进行比对，显示大多数所测序列具有较高同源性（94%~100%），61个序列分别归属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、热脱硫杆菌门和古细菌门七大类。所测序列共鉴定到19个属，其中有30个为未可培养细菌，且最亮条带鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus）。 DGGE回收的条带中鉴定的细菌种属有：芽孢杆菌属（Bacillus），玫瑰杆菌属（Roseobacter），副球菌属（Paracoccus），远洋杆菌属（Pelagibacter），泛菌属（Pantoeaagglomerans），甲烷微菌属（Methylomicrobium），放线菌属（actinobacterium），梭菌属（Eubacterium），棒状杆菌（Corynebacterium），地杆菌属（Geobacter），发光杆菌属（Photobacterium），根瘤菌属（Chelativorans），拟杆菌属（Bacteroidaceae），弧菌属（Vibrio），冷杆菌属（Psychrobacter），枝芽孢菌属（Virgibacillus），肠杆菌属（Enterobacter cloacae），粘球菌属（Myxobacterium），单胞菌属（Sphingomonas）。结果显示红树林滩涂海洋细菌具有丰富的多样性。