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湛江红树林沉积物多氯联苯提取物对斑马鱼血细胞和免疫反应的影响

Aftab Qamar  
【摘要】:目的 环境中的多氯联苯(PCBs)来源广泛且不易降解,在环境中持久存在。多氯联苯具有多种特性,包括生物毒性、高脂溶性以及在水体沉积物及在食物链中的生物累积性,对海洋中的鱼、虾、贝类等水生生物以及植物构成威胁。海洋中的食物资源丰富,而鱼类、贝类等水生生物是鱼粉的重要原料来源。含有多氯联苯的饲料如果被动物误食,就可能会在他们体内蓄积,对经济动物以及人类造成危害。免疫系统是预防疾病,保持健康的最重要防线,一旦受损可导致多种疾病,损害动物和人类健康。本研究以斑马鱼为模式生物,研究了湛江湾沉积物中多氯联苯的污染状况,并探讨了从湛江湾沉积物中提取的多氯联苯对斑马鱼免疫功能的影响。方法 采集湛江市3个红树林区的近海沉积物,采用硫酸和高锰酸钾超声辅助提取法结合Florisil柱纯化法前处理,再使用气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)测定了沉积物中PCBs的种类和浓度。取健康斑马鱼随机分为不同的处理组后放入曝氧的水缸(10升),每个鱼缸里养40条斑马鱼:对照组(CG)、阳性对照组(PC:Aroclor1254;10μg/L)、低剂量组(LD;0.6μg/L)、中剂量组(MD;3.0μg/L)和高剂量组(HD;15μg/L)。适应性喂养30天后开始为期14天的多氯联苯暴露实验,分别于实验第1、7、14天处死斑马鱼并采集各组的免疫器官(肠道、肝脏),在体重秤上测量肠道和肝脏的重量,计算肠肝指数。用HE染色法观察成年斑马鱼免疫器官的组织病理学变化。分析多氯联苯对成年斑马鱼免疫细胞(红细胞、白细胞、中性粒细胞计数)在PCBs暴露后的第1天、第7天和第14天的影响。采用实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)技术,研究了不同剂量(0、0.6、3.0、15μg/L)的多氯联苯提取物对斑马鱼肠道和肝脏细胞因子TNF-α、IL-1β和趋化因子IL-8基因表达的影响。结果 湛江红树林沉积物中10种多氯联苯预处理后的回收率为67.4%~90.6%,相对标准偏差(RSD)为24.15%~78.72%,各单体的检出限为0.02~0.06 ng/g,表明该方法准确可行,能满足这10种多氯联苯化合物的测定要求。本实验研究了广东省湛江市国家级红树林自然保护区(MNNR)、高桥红树林保护区(GMR)和雷州半岛(LP)3个采样点的沉积物中多氯联苯的含量。一共只检测到5种不同的PCBs:在MNNR和GMR沉积物中检出PCB153,LP沉积物中检出PCB101、PCB112、PCB155和PCB98。MNNR、GMR和LP沉积物中PCBs总量分别为1.29 ng/g、1.19ng/g和16.49 ng/g。实验发现PC组和HD组的体重指数从PCBs暴露的第1天起就有了显著的下降(P0.05),而第14天下降更为显著(P0.01),其他的处理组在第1天没有显著差异。MD组的体重在第7天显著下降(P0.05),在第14天极显著下降(P0.01)。另外,LD组第14天体重较CG组显著下降(P0.05)。各处理组体重的降低情况均与PCBs暴露的剂量和时间呈现相关性。PC组和HD组斑马鱼的肠道指数在第1天就显著低于CG组(P0.05),而在第14天时该变化达到了极显著的水平(P0.01)。LD组和MD组的肠道指数在第14天时显著降低(P0.05)。肝脏指数的变化是相反的。切片观察发现,多氯联苯暴露后的第1天,HD组的肠绒毛轻度损伤,肠上皮细胞(肠细胞)脱落,其他处理组未见异常。PCBs暴露后的第7天,HD组和PC组的肠绒毛严重损伤,杯状细胞和柱状吸收上皮细胞坏死,肠上皮细胞脱落。MD组肠绒毛轻度损伤。14天后,HD组肠绒毛不明显,上皮层消失,粘膜层细胞坏死,肠上皮细胞脱落;肠绒毛间隙不明显。MD组和PC组病变相似,而LD组仅在第14天的肠组织中出现了轻微损伤。在PCBs处理组中,肝细胞胞浆浓缩、肿胀,脊髓结构紊乱,出现不规则的脂滴。肝组织呈正常小叶结构,肝细胞和肝索正常。PCBs暴露组肝索结构紊乱,肝细胞肿胀,胞浆浓缩,慢性炎症细胞(主要是淋巴细胞)中度浸润,肝窦毛细血管扩张,中央静脉扩张,肝小叶坏死。但是这些区域中肝细胞很少出现凋亡,如核收缩、核固缩、核溶解和血窦扩张。PCBs对斑马鱼免疫细胞和基因表达的影响如下:PC组和HD组染毒第1天的斑马鱼红细胞数显著下降(P0.05),从第7天开始极显著下降(P0.01)。LD组和MD组的红细胞数明显减少(P0.05),第14天更明显减少(P0.01)。所有处理组的白细胞数在第1天均无明显变化,但是PC组和HD组的白细胞数在第7天明显减少(P0.05),在第14天极显著减少(P0.01)。而LD组和MD组白细胞数在第14天显著减少(P0.05)。所有处理组斑马鱼的中性粒细胞计数在第1天显著增加(P0.05),从第7天以后显著增加(P0.01)。斑马鱼细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α呈明显的“剂量时间-效果”关系(P0.05)。染毒后第1天,除PC组和HD组的IL-1β的表达显著增加外,其余各组均无显著变化(P0.05)。然而,从第7天开始,各处理组的IL-1β表达均显著高于对照组(P0.01)。PCBs暴露1天后,HD组和PC组IL-8的m RNA表达量显著增加(P0.05),其他各处理组均无明显变化,而在7天后,各处理组与对照组比较均有显著性差异(P0.01)。TNF-α在第1天除了在PC组和HD组显著升高外(P0.05),在其余各浓度组均无明显变化。但是,染毒7天后,它在各浓度组的相对表达均显著增加(P0.01)。斑马鱼肝组织中IL-1β、IL-8和TNFαm RNA的相对表达也有相似的结果。结论 湛江红树林区的沉积物受PCBs轻度至中度的污染。PCBs暴露可显著降低斑马鱼的体重和肠道指数,而肝脏指数则相反。沉积物中的多氯联苯提取物会引起斑马鱼肠道上皮细胞坏死和消失。肝组织也有组织病理学改变,如肝索结构紊乱,肝细胞肿胀,胞浆浓缩。沉积物中的多氯联苯提取物可显著降低红细胞和白细胞数,但显著增加中性粒细胞数。斑马鱼肠道和肝脏组织中IL-1β、IL-8和TNF-αm RNA的相对表达量均呈剂量和时间反应性增加,提示斑马鱼肠道和肝脏组织中存在炎症反应。


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