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牡蛎及其酶解产物抗皮肤光老化作用研究

吕佳桐  
【摘要】:香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)是中国南部沿海广泛养殖的一种经济贝类,其蛋白质含量丰富,从中提取得到的多肽有较好的活性,开发功能性食品潜力巨大,以牡蛎为原料制成的“海洋牛奶”备受消费者青睐。《本草纲目》中记载:“牡蛎肉,令人细肌肤、美颜色”,说明牡蛎具有美容护肤的功效。近年随着人们对皮肤衰老研究的深入,发现紫外线是导致皮肤衰老的最主要因素,因此探究牡蛎多肽的抗皮肤光老化活性有重要意义。本文采用酶解法制备香港牡蛎活性多肽,并对其分离纯化,通过小鼠皮肤光老化模型和光老化HaCaT细胞模型评价香港牡蛎活性肽的抗光老化活性。主要研究结果如下:(1)牡蛎肉粉(OM)蛋白浓度为605.2 g/kg,牡蛎酶解粉(OH)蛋白浓度为599.1 g/kg。通过UVA+UVB联合照射构建小鼠皮肤光老化模型,探究OM和OH的抗光老化活性。结果显示,OM和OH均可减轻小鼠皮肤皱纹,提高皮肤弹性,减少皮下血管的萎缩,防止血管通透性增加;HE染色结果表明,OM和OH可减缓表皮层过度角化增厚;Masson染色和醛品红染色结果表明,OM和OH可减少胶原纤维的卷曲和降解,避免弹性纤维的异常增生,恢复真皮细胞外基质网络的排列;与模型组相比,OM和OH可使皮肤中SOD和GSH-Px的活力显著提高,同时MDA和8-OHDG的浓度降低;与模型组相比,中、高剂量的OM和OH可抑制MMP-3和MMP-9的表达,显著降低真皮中Hyp的降解;与模型组相比,高剂量的OH可显著降低皮肤中IL-6和TNF-α的表达,并提高TGF-β表达。综上,OM和OH具有抗氧化、抑制皮肤基质降解和抗炎活性,二者均表现出抗皮肤光老化活性,同等剂量下OH优于OM。因此本研究对OH进一步分离,继续采用小鼠光老化皮肤模型,并增加相应生化指标,筛选抗光老化的最优组分。(2)OH经过陶瓷膜初滤、超滤膜超滤后得到5 ku、3-5 ku和3 ku三个组分,蛋白浓度分别为654.9 g/kg、674.5 g/kg和672.7 g/kg。采用与上一章同样的动物模型和灌胃剂量探究各组分抗光老化活性。结果显示,5 ku组分和3-5 ku组分均能够使光老化皮肤的皱纹减轻、起到防止皮肤呈皮革样增厚、增加皮肤弹性的作用,而3 ku组分效果不明显。3-5 ku组分能够改善毛细血管萎缩和通透性增加的状况。HE染色和Masson染色结果显示3-5 ku组分可降低表皮层的增厚程度,减缓皮肤中胶原纤维扭曲聚集,使之排列规则,分布均匀。与模型组和其他剂量组相比,3-5 ku组分在提高皮肤中SOD和GSH-Px含量,降低皮肤中MDA和8-OHDG含量上效果最显著。与模型组相比,5ku高剂量组和3-5 ku所有剂量组均可降低MMP-1和MMP-9含量,3-5 ku中剂量组可显著减少MMP-1在真皮层的堆积,所有超滤组分对MMP-3无显著影响,3-5 ku高剂量组增加皮肤中Hyp含量最显著,接近于空白组。3-5 ku高剂量组有较好的抗炎能力,IL-6和TNF-α含量接近空白组,无显著差异,所有超滤组分对皮肤中TGF-β无显著影响。综上,3-5 ku组分的抗光老化效果最好,对其进行进一步分离。(3)采用Sephadex-G25凝胶柱层析对3-5 ku组分分离纯化得到七个组分(OP1-OP7)。结果表明,OP5和OP7蛋白含量在95%以上,七个组分均以多肽为主,总糖含量均较低。OP5、OP6和OP7的总抗氧化能力优于OP1、OP2、OP3和OP4。红外图谱分析表明OP3中含有少量多糖,OP5具有羧酸官能团,且分子结构不对称。质谱及分子量分析结果表明,OP3的三个主要的蛋白来源为甘油醛3磷酸脱氢酶、Ⅰ型肌动蛋白(牡蛎源)以及细胞质热休克蛋白70;OP5的三个主要的蛋白来源为Ⅱ型肌动蛋白(牡蛎源)、ATP合酶FO6亚基以及甘油醛3磷酸脱氢酶。OP3的分子量约为2843 k Da-2876 k Da,OP5的分子量约为2474k Da-2524 k Da。(4)开展OP3、OP4、OP5对HaCaT细胞增殖的研究,结果表明,OP3和OP5在25-200μg/m L作用浓度下对HaCaT细胞增殖有促进作用;OP4无细胞增殖促进作用,并在大于400μg/m L作用浓度下显著导致细胞凋亡。采用UVA+UVB联合照射的光老化HaCaT细胞模型探究OP3和OP5的抗光老化活性,结果表明,OP3和OP5均能够减少HaCaT细胞内的自由基(ROS)含量,最优作用浓度分别为25μg/m L和100μg/m L。OP3和OP5均能够降低HaCaT细胞因紫外线刺激分泌的MMP-1和MMP-9含量,并能够增加PINP表达,最佳作用浓度均为25μg/m L,OP3在降低MMPs含量上优于OP5。


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