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酶解军曹鱼头制备ACE抑制肽的研究

蒋予川  
【摘要】: 高血压已成为引起人类死亡的主要病因之一,来源于食品蛋白的降血压肽,由于安全性高、易吸收,具有巨大的市场潜力。本论文以军曹鱼头为原料,经酶法、超滤、凝胶层析、高效液相色谱等技术研究了制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的工艺条件和技术方法,获得具有较高ACE抑制活性的军曹鱼头降血压肽。并通过动物实验证实了所制备的降血压肽具有显著的降压效果。研究结果如下: 1对军曹鱼头营养成分进行了分析与评价。结果显示:军曹鱼头水分含量67.5%,粗蛋白14.75%,粗脂肪12.68%,灰分5.21%,非蛋白氮161mg/100g;脂肪酸的不饱和度为56%,EPA和DHA的含量高;总氨基酸含量为14274mg/100g,游离氨基酸含量为293mg/100g,必需氨基酸为4418 mg/100g,芳香族氨基酸、支链氨基酸和脯氨酸占结构氨基酸的含量分别为5.62%、14.46%、7.85%,第一限制氨基酸为蛋氨酸和半胱氨酸,氨基酸评分为84。表明军曹鱼头含有高蛋白高脂肪,蛋白质营养价值高,适合作为酶法制备降血压肽的原料。 2.优化了酶解法制备ACE抑制肽的工艺条件。采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶五种蛋白酶对军曹鱼头进行单酶酶解,研究了不同酶解时间酶解物的ACE抑制率,筛选出木瓜蛋白酶2h的酶解产物的ACE抑制率最高为70.07%。以ACE抑制率为响应值,选取温度、加酶量、pH值三因素设计中心组合实验,结合不同时间水解度确定制备军曹鱼头ACE抑制肽的最佳酶解条件为:料液比1:2、温度72℃、加酶量2300 U/g原料、pH6.0、水解时间4h,ACE抑制率为82.63%,水解度为17.21%。 3.采用截留分子量8KDa、5KDa、3KDa的超滤膜对酶解液进行分级分离,得到四种超滤组分,探讨了超滤组分的ACE抑制活性、分子量分布和消化耐受性。结果表明:四种组分的ACE抑制活性随着分子量的减小而增强,其中组分Ⅳ(3KDa)的ACE抑制活性最强,IC50为0.24 mg/mL,可溶性蛋白比重占酶解液的70.47%。对组分Ⅳ进行HPSEC测定,3KDa以下的肽占80.18%。对组分Ⅳ进行胃蛋白酶、胰蛋白酶以及胃蛋白酶+胰蛋白酶消化处理,消化后水解液中的肽的分子量向低分子量移动,其IC50值均有所降低。说明组分Ⅳ对胃肠道酶系具有较好的耐受性。 4采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析分离组分Ⅳ,得到三个吸收峰,探讨层析组分的ACE抑制率、保温稳定性、氨基酸组成。结果表明:组分B的ACE抑制活性最强,IC50为0.004 mg/mL。酶解液中含有药物前驱型ACE抑制肽,组分Ⅳ为抑制剂型,Sephadex G-25分离组分是底物型ACE抑制肽。组分Ⅳ和组分B的支链氨基酸、芳香族氨基酸和脯氨酸总和占结构氨基酸的含量分别为29.66%和45.14%。表明通过葡聚糖凝胶层析,ACE抑制肽得到了富集。 5.通过动物实验考察了组分Ⅳ的降血压效果。以组分Ⅳ冷冻干燥品,灌胃原发性高血压(SHR)大鼠,观察血压在24h内的变化情况。结果表明:低剂量组以150mg/kg体重灌胃SHR,4h后SBP降幅最大为3 2 mmHg,小于阳性对照组卡托普利体重灌胃的降压效果;中剂量组以600mg/kg体重灌胃SHR,6h后SBP降幅最大为44 mmHg,与阳性对照组的降压效果相仿;高剂量组以1200mg/kg体重灌胃SHR,4h后SBP降幅最大为57mmHg,降压效果比阳性对照组好。此外,超滤组分Ⅳ对正常血压的WKY大鼠无显著降血压作用,对SHR的心率无显著影响。


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