南极衣藻谷胱甘肽还原酶基因的克隆、表达与定量分析

【摘要】： 谷胱甘肽还原酶(GR)是生物体内重要的抗氧化酶。本研究对南极衣藻GR的全长cDNA进行克隆,并构建了该基因的原核表达载体。同时,分析了GR基因在不同盐度和CdCl2作用前后的表达变化。此外,还克隆了南极冰藻β-肌动蛋白基因(ICE-L actin GenBank accession number:HM114222)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ICE-L GAPDH GenBank accession number:HM114223)的部分cDNA序列。 以提取的南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L总RNA为模板,根据报道的多种藻类及植物的谷胱甘肽还原酶保守区设计简并引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了ICE-L GR基因(GenBank accession number:GU395492),并对其进行了全面的生物信息学分析。ICE-L GR全长1913bp,包含90bp的5′非编码区(UTR)和365bp的3′UTR;开放阅读框(ORF)长1458bp,编码485个氨基酸,终止密码子为UGA,分子量计算值(MW)为52.155kDa,理论等电点(PI)为5.56;ICE-L GR氨基酸序列与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、绿色鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus)、海链藻(Thalassiosira pseudonana)、石莼(Ulva fasciata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、芥菜(Brassica juncea)、大豆(Glycine max)、及水稻(Oryza sativa)的GR氨基酸序列同源性较高。 在克隆GR全长的基础上,构建了其原核表达载体pET-GR,并将其导入大肠杆菌BL21进行融合蛋白的表达,SDS-PAGE电泳结果显示,获得目的蛋白符合预计分子量。通过对诱导时间、IPTG浓度、温度的优化,最终确定GR蛋白在大肠杆菌中诱导表达优化条件为:IPTG浓度为1.0mmol/L,28℃诱导3h;且表达的蛋白均以包涵体的形式存在。 应用实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR),以ICE-Lβ-actin和ICE-L GAPDH基因为内参照,研究了ICE-L GR基因在低盐度、高盐度和不同浓度CdCl2(μmol/L)作用前后的表达变化。在偏离最适生长盐度下,盐度11、22、66在第24h表达量最大,盐度99在12h达到最大表达量;重金属CdCl2作用后,低CdCl2浓度诱导表达上调,20、40μmol/L在第12h最大量表达,60、80μmol/L在第18h表达量最大。 本论文的研究结果为探讨南极冰藻谷胱甘肽及其相关酶基因的作用机理和调控机制奠定了坚实的基础;丰富生物谷胱甘肽还原酶基因的普遍性和多样性;对于全面了解和认识南极生物谷胱甘肽相关酶基因的结构、功能、特性,有效地阐明南极微生物对各种胁迫的适应性都具有重要的理论指导意义,而且能为抗逆领域特别是抗逆基因工程提供新的思路和新的基因。