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人巨细胞病毒感染与胆道闭锁CD4~+T细胞因子相关性研究

张锐忠  
【摘要】:目的 1.检测几种常见嗜肝DNA病毒在胆道闭锁患者肝脏组织中的感染率,探寻其中与胆道闭锁关系最为密切者,并观察该病毒在体外对胆道上皮细胞的的形态学影响; 2.分析胆道闭锁患者肝脏组织中人巨细胞病毒与11种CD4~+T细胞因子表达水平之间的相关性。 方法 1.病例标本 新鲜肝脏组织标本来自85例胆道闭锁患者,其中男50例,女35例。并选取新近收集的29例进行流式细胞学检测。同时收集对照组病例9例,其中6例来自引产胚胎,3例来自新生儿肝炎患者。 2.荧光定量PCR 切取肝脏标本提取DNA,DNA用紫外可见分光光度计进行DNA质量检测后再做FQ-PCR检测。分别对HCMV、ADV、EBV、HBV和HSV 5种病毒进行FQ-PCR进行检测。 3.病理及免疫组织化学染色 甲醛固定的肝脏标本制成石蜡切片后,进行病理染色和免疫组化检测。病理染色采用HE染色、MASSON染色、个别采用嗜银染色;免疫组织化学染色方法采用二步法对肝脏组织的细胞因子IFN-γ及巨细胞病毒晚期蛋白PP65进行检测,DAB显色。以IFN-γ及PP65表达位于胞浆内,有明显棕黄色颗粒状染色为阳性。 4.流式细胞学检测 将肝脏组织研磨成组织匀浆,取上清。采用流式微球技术同时对11种细胞因子进行定量检测,具体细胞因子包括:IL-12p70、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-8、IL-6、IL-4、IL-5、IL-1β、TNF-α和TNF-β。最终各细胞因子浓度(pg/ml·mg)=流式结果(pg/ml)/重量(mg)×500。 5.人巨细胞病毒培养及其对人胆道上皮细胞形态学影响 5.1人巨细胞病毒培养 自行分离提取培养人胚肺成纤维细胞,第3-10代人胚肺成纤维细胞用于本实验,接种HCMV AD 169,对病毒进行培养、扩增,培养过程及结果用FQ-PCR对其病毒滴度进行监测。 5.2人巨细胞病毒感染对胆道上皮细胞的影响 人肝内胆管上皮细胞接种HCMV AD169株后,每天用倒置相差显微镜观察,至发生明显病变效应时收获。用FQ-PCR检测培养前后病毒滴度变化,再用透射电镜观察细胞形态学变化及病毒状况。 6.统计用SPSS 13.0软件计算HCMV滴度与各细胞因子表达量之间的相关系数r。 结果 1. 5种嗜肝DNA病毒在胆道闭锁肝脏组织中的感染率荧光定量PCR实验结果表明,85例胆道闭锁患者肝脏组织中,嗜肝DNA病毒阳性56例(65.8%),其中HCMV阳性51例(60%),ADV阳性5例(5.9%),EBV阳性3例(3.5%),HSV阳性0例(0%),HBV阳性0例(0%),其中3例出现病毒混合感染, 2例为HCMV和ADV混合感染,另外一例为ADV和EBV混合感染。对照组9例均未检测到病毒的存在。 2.胆道闭锁组织病理变化 胆道闭锁肝脏组织可见肝小叶有不同程度的肝细胞变性坏死、胆汁淤积,部分可见肝多核巨细胞和假小叶形成,汇管区胆栓形成、胆小管增生、胆道上皮细胞变性。以胆小管为中心,淋巴细胞和粒细胞浸润生长,不同程度的纤维束包裹胆小管。 3.人巨细胞病毒对人胆道上皮细胞形态学影响及PP65在BA中的分布情况 在接种HCMV AD169后,胆道上皮细胞出现细胞病变效应现象,FQ-PCR显示培养后上清中人巨细胞病毒滴度明显升高,电镜下观察到细胞凋亡现象及大量巨细胞病毒在胞浆中存在。 85例肝脏标本中,pp65免疫组化阳性43例(50.58%),阴性42例,对照组9例皆为阴性。PP65均位于感染细胞胞浆中,阳性细胞多较集中分布于肝细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞和炎性浸润细胞。其中胆管上皮细胞呈强阳性反应。4.流式细胞学结果 与对照组相比,BA组中11种细胞因子表达水平均不同程度增高,其中Th1细胞因子总量(IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α、TNF-β)与促炎因子总量(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α、TNF-β)的增高幅度较Th2细胞因子总量(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10)及抗炎因子总量(IL-4、IL-5、IL-10)的增高幅度明显。 5. IFN-γ在胆道闭锁患者肝脏组织中的表达情况 85例肝脏标本中IFN-γ免疫组化检测阳性51例(60.0%),阴性34例,对照组阴性表达。IFN-γ表达范围主要在汇管区,以增生小胆管为中心,主要表达在胆管周围的炎症细胞胞浆中,胆道上皮细胞呈弱阳性表达。 6.人巨细胞病毒滴度与11种CD4~+T细胞因子的相关性分析 进行流式细胞学检测的29例胆道闭锁患者中HCMV阳性者15例(51.72%),15例BA患者肝脏组织中人巨细胞病毒滴度与11种细胞因子具有不同程度的相关性,其中与部分细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α及TNF-β)呈强正相关,以IFN-γ的相关性最强(r=0.796),且该病毒的滴度与Th1细胞因子总量(r=0.914)、促炎因子总量(r=0.913)及11种细胞因子总量(r=0.893)呈强相关性。 结论 1.胆道闭锁与嗜肝DNA病毒感染之间存在较强的相关性,其中人巨细胞病毒与胆道闭锁之间的相关性较大,人巨细胞病毒对胆道上皮细胞具有侵袭性,可诱发胆道上皮细胞凋亡; 2.胆道闭锁有可能是由人巨细胞病毒感染所促发,主要由CD4~+Th1细胞及其细胞因子所介导的针对胆道上皮细胞的免疫炎症性疾病。


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