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Fmr1基因敲除小鼠的行为学观察及GAD在其脑组织中的表达

毛利冰  
【摘要】:脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是最常见的遗传性智力低下性疾病之一,发病率仅次于Down综合征,占非特异性智力低下的2%-6%,在X连锁智力低下中占40%。其致病基因—FMR1基因(fragile X mental retardation 1)三核苷酸重复序列异常扩增导致编码产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)减少或缺失。FXS患者存在有不同程度的智力低下、注意力障碍、视觉运动整合障碍、癫痫发作、性格改变、孤独、活动过度、自闭、感觉过敏、大睾丸、特殊面容和焦虑等社会行为的异常。上述临床多样性可能与以下因素有关:①FMR1基因表达程度的变异导致FMRP产量的不同;②其他背景基因直接或间接对FMRP的影响;③环境因素。因此,为了发现FXS患者发病的复杂机制,FXS患者的智力、行为等方面的相关问题正成为研究热点。目前,FXS小鼠模型的行为学研究主要集中在学习记忆能力、活动、社会关系、焦虑、运动能力、感觉刺激特异反应等方面。鉴于FXS患者的癫痫易感,采用FXS小鼠模型进行癫痫研究也是目前研究的热点。本研究第一部分对KO鼠进行行为学观察;第二部分观察谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)在KO鼠在脑组织中表达的改变。试图探讨KO鼠行为异常与GAD的关系,为脆性X综合征的发病机理和寻找治疗方案提供一定的依据。材料与方法 FMR1基因敲除小鼠和野生型小鼠基因型鉴定后,经广州医学院实验动物中心饲养及繁殖。第一部分采用听源性惊厥、Morris水迷宫、自主活动、避暗、跳台、旷场实验对FMR1基因敲除小鼠与野生型小鼠进行行为观察。第二部分采用免疫组织化学和蛋白印迹两种方法观察GAD65/67神经元数量和蛋白在KO鼠中皮质和海马区表达及变化。 结果 1.听源性惊厥实验结果不同周龄KO鼠都有AGS发作,3周龄KO鼠的AGS易感性最强,但存在低几率惊厥程度评分;而WT鼠的AGS易感性,但无癫痫持续状态。随着年龄的增加,KO鼠的AGS发作率逐渐下降,惊厥程度评分逐渐增加,而WT鼠无AGS发作。 2.Morris水迷宫实验结果(1)空间航行实验 第一天至第三天实验中KO鼠与WT鼠的潜伏期和穿越平台次数无明显差异(P0.05);在第四天实验中KO鼠的潜伏期和穿越平台次数比WT鼠有明显差异(P0.05);6周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期和穿越平台次数与4周龄相比无明显差异(P0.05)。 (2)空间搜索实验 4周龄和6周龄WT鼠在目标象限停留时间比其它象限停留时间长;而6周龄KO鼠在第四象限停留的时间长;4周龄KO鼠在第二象限停留时间长。3.旷场实验结果 同周龄KO鼠和WT鼠在第一区域(周围区域)停留时间无差异(P0.05),但在第四区域(中央区域)停留时间有差异(P0.05);同周龄KO鼠在四个区域运动长度比WT鼠明显长(P0.05);其跨过中央区域次数比WT鼠明显多(P0.05);其在中央区域的activity、ambulation次数比WT鼠明显多(P0.05);但两者在运动速度和站立不动方面无明显差异(P0.05);不同周龄KO鼠或WT鼠各项指标相比无差异(P0.05)。 4.自主活动实验、避暗实验、跳台实验的结果 (1)自主活动结果同周龄KO鼠的活动次数比WT鼠明显多(p0.05);而KO鼠的站立次数比WT鼠明显少(p0.05);不同周龄KO鼠或WT鼠活动次数、站立次数无差异(P0.05);第一天KO鼠或者WT鼠活动次数和站立次数与第二天相比无差异(p0.05 )。 (2)避暗实验结果 同周龄KO鼠潜伏期比WT鼠明显少(p0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(p0.05);不同周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(p0.05 );第一天KO鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比无差异(p0.05 );第一天WT鼠的潜伏期和错误与第二天相比无差异(p0.05 )。 (3)跳台实验结果 同周龄KO鼠的潜伏期比WT鼠明显少(p0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(p0.05);不同周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P0.05);第一天KO鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比无差异(p0.05 );第一天WT鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比有显著差异(p0.05)。 5.GAD在KO鼠脑组织中的表达 (1)GAD65/67免疫组织化学方法GAD65/67阳性神经元数量在KO鼠表达(皮质、海马区)比WT鼠减少(p0.05);随着周龄的增加,6周龄KO鼠或WT鼠的GAD65/67阳性神经元数量在(皮质、海马区)表达比2周龄增多(p0.05)。 (2)GAD65/67蛋白印迹法GAD65/67蛋白在KO鼠表达(皮质、海马)比WT鼠增多(p0.05);随着周龄的增加,6周龄KO鼠或WT鼠的GAD65/67蛋白表达(皮质、海马)比1周龄表达(皮质、海马)增多(p0.05)。 小结 1.KO鼠存在听源性惊厥易感、运动能力增加、兴奋性及探索行为增加、学习记忆能力低下,说明KO鼠的许多行为表现与FXS患者相似,提示上述KO鼠行为表现可能与FMRP表达水平有关。 2. KO鼠的GAD阳性神经元数量及蛋白改变可能与FXS的癫痫和异常行为有关。


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