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眼镜蛇细胞毒素CTXn、CTX1戒毒作用及其机制的实验研究

仲维高  
【摘要】:目的:探讨眼镜蛇毒细胞毒素有效组分CTXn、CTX1对抗吗啡依赖作用及机制。方法: (1)建立吗啡依赖CPP模型,观察眼镜蛇毒中分离粗毒细胞毒素Ⅳ低、中、高剂量对吗啡成瘾大鼠CPP影响,及对催促戒断行为学影响。 (2)筛选: SD大鼠吗啡(10mg/kg,sc)训练8天,形成稳定CPP模型后,大鼠分为粗毒毒素Ⅳ各单体组分高剂量组、吗啡成瘾对照组及0.9%N.S组,实验组给予粗毒毒素Ⅳ不同组分1/10 LD50剂量,观察各组分对吗啡已形成CPP影响。 (3)观察CTXn对吗啡CPP获得和维持影响。①建立吗啡依赖模型后,腹腔给予CTXn不同剂量(0.5、1.0、2.0mg/kg)连续5天,测试CPP及痛觉变化,大脑切片,免疫组化染色,观察TNF-α在齿状回表达;②SD大鼠在施吗啡前30分钟腹腔给予不同剂量CTXn(0.5、1.0、2.0mg/kg),连续8天,观察CTXn预处理对吗啡CPP获得及镇痛影响;③SD大鼠腹腔注射不同剂量CTXn(0.5、1.0、 2.0mg/kg),连续18天,观察其自身是否引起CPP;④SD大鼠分别腹腔给予CTXn(1.0mg/kg)或鞘内给予CTXn(0.025mg/kg),连续用药24天在d0、d2、d4、d6、d8、d10、d12、d14、d16、d18、d20、d22、d24测试大鼠痛阈,观察痛阈变化,同时在d0、d4、d8、d12、d16、d20、d24采用ELISA法检测血清抗体效价。 (4)观察CTX1对吗啡CPP获得和维持影响。①建立吗啡依赖模型后,再腹腔给予不同剂量CTX1(0.1、0.2、0.4mg/kg)连续5天,测试CPP及痛觉变化,大脑切片,免疫组化染色,观察TNF-α在海马的表达;②SD大鼠在施吗啡前30分钟腹腔给予CTX1不同剂量(0.1、0.2、0.4mg/kg),连续8天,观察CTX1预处理对吗啡CPP获得及镇痛影响、TNF-α的含量变化及其在CA区表达、LTP;③SD大鼠腹腔注射不同剂量CTX1(0.1、0.2、0.4mg/kg),连续8天,观察其自身是否引起CPP;④SD大鼠分别腹腔给予CTX1(0.2mg/kg)组或鞘内给予CTX1(10μg/kg),连续用药24天在d0、d2、d4、d6、d8、d10、d12、d14、d16、d18、d20、d22、d24测试大鼠痛阈,观察痛阈变化,在d0、d4、d8、d12、d16、d20、d24采用ELISA法检测血清抗体效价。 结果: (1)吗啡可诱导大鼠产生明显CPP,眼镜蛇粗毒细胞毒素Ⅳ高、中、低剂量组自身均不能引起CPP;不同剂量粗毒细胞毒素Ⅳ可抑制吗啡已形成CPP,抑制纳洛酮诱导的戒断症状。 (2)细胞毒素Ⅳ分离纯化得到5个组分,分别为:Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ4、Ⅳ5、Ⅳ7。其中组分Ⅳ4、Ⅳ5可抑制大鼠引起CPP;抑制纳洛酮诱发戒断症状,与组分Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ7不同,组分Ⅳ4、Ⅳ5组大鼠体重平均增长分别为:15.5%、17.1与生理盐水组增长相似,Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ7组大鼠体重平均增长为6.2%、4.9、8.8%与吗啡对照组相似。氨基酸序列测定组分Ⅳ4为CTXn,组分Ⅳ5为CTX1。CTXn序列:LKCNQ LIPPF YKTCA AGKNL CYKMF MVAAP KVPVK RGCID VCPKS SLLVK YVCCN TDRCN CTX1序列:LKCNK LIPIA SKTCP AGKNL CYKMF MMSDL TIPVK RGCID VCPKS NLLVK YVCCN TDRCN (3)CTXn对吗啡CPP获得和维持影响①大鼠吗啡成瘾后CTXn处理可剂量依赖性地抑制吗啡诱导CPP及痛敏。CTXn不同剂量组(0.5、1.0、2.0mg/kg)CPP值分别从成瘾时的451.8s±49.2s、450.8s±72.3s及450.7s±91.2s下降到164s±49.5s、77.4s±41.1s及68.2s±37.2s;大鼠痛阈值分别从成瘾时15.5s±1.6s、15.2s±3.2s及15.6s±2.3s,提高至22.4s±1.7s、27.5s±2.8s及28.6s±3.6s。②吗啡成瘾后,CTXn后处理可明显增加齿状回TNF-α表达,一定程度上恢复齿状回神经元数量。③CTXn预处理后,大鼠CPP值未见显著升高,可剂量依赖性抑制吗啡CPP获得。预处理呈剂量依赖性的增强镇痛作用。④CTXn自身不会产生CPP。CTXn腹腔用药后,血清CTXn抗体效价增高,镇痛效力下降;但CTXn鞘内给药未见CTXn抗体产生及镇痛耐受。 (4)CTX1对吗啡CPP获得和维持影响:①大鼠吗啡成瘾后CTX1后处理可剂量依赖性地抑制吗啡诱导CPP维持及痛觉过敏。大鼠成瘾后,CTX1处理可明显增加海马CA区TNF-α表达。②CTX1预处理可剂量依赖性地抑制吗啡诱导CPP获得,镇痛作用呈剂量依赖性。CTX1可明显增加在血清中TNF-α含量及在海马CA区表达,解除吗啡对LTP的影响。③CTX1自身不会产生CPP。CTX1腹腔用药后,血清抗CTX1抗体效价逐渐增高,镇痛作用相应下降,但CTX1鞘内给药后未见抗体产生及镇痛耐受。 结论: (1)细胞毒素Ⅳ中分离纯化的单体组分CTXn和CTX1剂量依赖性抑制吗啡诱导CPP获得及维持。 (2)CTXn和CTX1自身没有成瘾性,二者可抑制吗啡诱导CPP获得,预防吗啡成瘾,有良好镇痛作用,可抑制吗啡痛敏,长期应用会产生抗体引起镇痛耐受导致镇痛效力降低,鞘内给药可避免。 (3)CTXn促进TNF-α在海马齿状回表达、促进神经元恢复。CTX1可增加TNF-α的含量,促进TNF-α在中枢海马表达,影响吗啡成瘾大鼠LTP。 (4)CTXn、CTX1对吗啡成瘾有较好抑制和预防作用。


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