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含钙肾结石患者肾组织中TRPV5的表达

何锦园  
【摘要】:一、研究背景: 泌尿系结石是泌尿外科最常见的疾病之一,也是一全球性的疾病。我国的泌尿系结石发病率有逐年增加的趋势,我国南方还是世界三个主要的泌尿系结石流行区之一。尿石症有易复发的倾向,而目前的预防措施并不令人满意。研究表明:发生草酸钙结石后1年内,有10%男性会发生新的草酸钙结石,10年内有50%会发生新结石。鉴于此,我们有必要对泌尿系结石的病因进行研究,进而有效预防泌尿系结石的发生及复发。 目前认为泌尿系结石是多因素共同作用下所形成的,其病因主要有内在的遗传因素、代谢因素及外在的环境、饮食等因素,代谢因素是近年研究的热点。病因学的研究已经充分证实了体内钙的代谢异常是导致含钙尿路结石的重要因素之一。含钙结石是最常见的泌尿系结石,主要包括草酸钙结石和磷酸钙结石。虽然泌尿系结石的结石成分有多种,但至少90%以上为含钙结石,其中约1/3存在着高钙尿症。研究表明,尿液中的草酸钙和磷酸钙的饱和度与尿钙的浓度相关,尿钙增高易于诱发或促进含钙结石的形成。尿钙的水平取决于肾小球的滤过和肾小管对钙的重吸收,人体内进入肾脏的钙85%在近曲小管和Henle袢粗支升段被动重吸收,剩余约15%则在肾脏远曲小管后段(DCT2)和集合管(CNT)主动重吸收。尿钙的主动重吸收过程是:钙离子通过上皮细胞钙离子通道蛋白(TRPV5)介导经DCT2和CNT上皮细胞顶膜入细胞质、与载体蛋白Calblindin-D28k结合并扩散至细胞外侧基底膜、通过转运蛋白NCX1和PMCA1b经基底膜入血液循环。主动重吸收虽然只占钙总的重吸收的少部分,但其不同于于被动重吸收,它受甲状旁腺素(PTH)、1,25-二羟维生素D3等多因子的调节,是一种耗能的主动转运,因此是影响尿钙水平的重要因素。 TRPV5是尿钙重吸收的上皮通道蛋白,主要表达于肾远曲小管和集合管上皮细胞管腔侧,通过结合尿液中Ca2 +主动重吸收入机体,进而调节尿钙水平,维持机体钙平衡。目前的多项研究显示TRPV5表达下降或活性降低可能导致尿钙水平升高。可见,TRPV5和高钙尿、含钙肾结石之间可能存在某种联系。本研究收集我院含钙肾结石患者和正常无结石者肾皮质的两组标本各5例,通过免疫组织化学、Western Blot以及荧光定量PCR技术,比较两组间在形态学上的差异及TRPV5蛋白、TRPV5mRNA的表达差异,研究TRPV5在含钙肾结石形成中的作用,从而为泌尿系结石病的预防提供理论依据。 二、研究目的: 通过比较钙离子通道TRPV5在含钙肾结石患者和正常无结石者肾中的表达差异,探讨TRPV5在含钙肾结石形成中的作用,并为寻找尿石症的有效预防措施提供理论依据。 三、研究方法: 1、实验标本来源: 实验分两组,每组5例,共10例。结石组选24H尿液分析结果尿钙水平高于正常的(300mg/24h)且术后常规结石成分分析证实为含钙结石的患者5例,男性2例,女性3例,平均年龄44岁,其中肾铸型结石2例,多发性结石3例,于经皮肾镜取石术术毕退鞘时取少量肾皮质。对照组5例尿钙均正常,男性3例,女性2例,平均年龄49岁,其中3例为UPJ梗阻患者,2例为肾癌患者,于开放手术时在肾脏正常极取少量肾皮质,无皮质萎缩等其他因素影响。5例患者术前经B超和IVP等诊断均无结石,术中也未发现结石。每例标本取样均装于灭菌处理的EP管中,加1ml样品保护剂,于—80℃冰箱保存。 2、H-E染色及免疫组织化学: 切取每例标本,大小为3*3mm-3*5mm,要求组织结构完整,做成石蜡切片,先进行常规H-E染色并证实是肾皮质的组织结构,然后以无TRPV5表达的SD大鼠肝脏组织作为阴性对照,分别进行免疫组化染色,比较两组之间在形态学上的差异。 3、Western Blot: 另取每例肾皮质用蛋白提取试剂盒,依其步骤分别提取蛋白,经垂直电泳、转膜、封闭过夜、一抗二抗孵育、化学发光、显影定影等步骤行Western Blot,从蛋白水平比较TRPV5蛋白在两组间的表达差异。 4、荧光定量PCR: 用TRIzol法提取每例标本的总RNA,再逆转录为cDNA,进行荧光定量PCR反应,从基因水平比较结石组和对照组TRPV5mRNA的表达差异。 5、结合数据,统计学分析。 四、研究结果: 1、H-E染色及免疫组化结果 普通光学显微镜下可见各例标本经H-E染色后散在的圆形红染的肾小体和呈大小不等腔状断面的近曲小管、远曲小管及少数集合管,其中远曲小管及少数集合管的官腔较大,上皮细胞较小,呈立方状,排列紧密,由此可证实为肾皮质标本。免疫组化染色发现结石组和对照组的肾远端小管和集合管上皮细胞的细胞膜均有棕黄色的阳性染色颗粒,而阴性对照未发现。结石组的肾小管上皮细胞脱落、结构受损,完整的肾小管数量有所减少,并且其TRPV5的阳性染色强度明显低于对照组。 2、Western Blot结果 依据Quantity One4.62版软件得出的各灰度值,对照组各例TRPV5的蛋白印迹基本相近,分析结果显示统计学差异不显著(153.91±3.44 vs 150.92±0.81 vs 148.70±2.31 vs 142.17±6.93,P0.05);结石组的灰度值分析亦显示各例之间无明显统计学差异(96.89±22.92 vs 104.51±12.14 vs 90.19±8.12 vs 93.75±10.14)。再分别计算出各例TRPV5条带和相对应的β-Actin条带的灰度值的比值,结果示结石组的TRPV5表达低于对照组,t检验证明有统计学意义(t=6.433.355,p0.01)。 3、荧光定量PCR结果 依据荧光定量PCR仪所测的各CT值(CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。)计算出各例TRPV5 CT值和内参照GADPH CT值的比值,t检验证明结石组TRPV5mRNA表达水平低于对照组,有统计学差异(t=5.342.306,p0.05),MXPro4.01分析软件得出相对定量图显示结石组肾皮质TRPV5mRNA表达量是对照组的0.248倍。 五、研究结论: A:含钙肾结石患者和正常无结石者的肾皮质组织结构在形态学上存在差异,前者存在肾小管上皮细胞脱落、结构受损,且细胞膜阳性染色强度更低于后者。 B:TRPV5蛋白在含钙肾结石患者的肾组织中表达低于正常无结石者。 C:在基因水平,含钙肾结石患者的TRPV5mRNA的表达低于正常无结石者。


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