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产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的检测及耐药特点研究

黄丽燕  
【摘要】:研究背景肠杆菌科细菌是社区获得性感染和医院获得性感染的重要条件致病菌,主要引起呼吸系统感染和泌尿系统感染,在免疫力低下的患者中可引起严重甚至致死性的感染。而碳青霉烯类抗菌药物是目前临床上作为治疗肠杆菌科细菌感染最强而有力的一类抗菌药物,包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等,其对极大多数由质粒或染色体介导的β-内酰胺酶都有较高的稳定性,且与青霉素结合蛋白(PBPs)亲和力强,能有效地渗透细菌外膜,并存在抗生素后效应,因其抗菌谱广、抗菌活性强、杀菌作用快,临床上碳青霉烯类抗菌药物广泛用于治疗产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)细菌引起的感染。但是随着碳青霉烯类抗菌药物的大量使用,国内外开始报道对碳青霉烯类抗菌药物不敏感甚至耐药的肠杆菌科细菌,这极大地限制了碳青霉烯类抗菌药物的使用,产生这一现象的重要原因是菌株获得了碳青霉烯酶基因。其中由质粒携带的碳青霉烯酶基因由于其耐药基因环境存在介导转移的基因元件,使得其易于在不同细菌间转移,造成了碳青霉烯酶耐药性的广泛传播,成为近年临床微生物学领域备受关注的热点之一。本研究通过采用法国梅里埃Vitek2全自动微生物鉴定仪与药物敏感仪对收集的耐药菌株进行鉴定及药敏分析,对本院可疑的产碳青霉烯酶菌株进行多重PCR检测碳青霉烯酶基因,并对耐药基因阳性的菌株进行接合转移实验,以了解耐药基因的传播方式;通过高通量测序技术对其中一株接合转移成功的多重耐药菌株进行质粒全序列的测定,获得的全序列通过生物信息学分析,展开对肺炎克雷伯菌耐药基因环境及耐药机制的研究。研究目的了解本院临床分离的肠杆菌科菌株的耐药特点及产碳青霉烯酶情况,探讨产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌耐药基因的传播方式及可能的耐药机制,为临床控制耐药基因的传播提供一定的实验依据。研究方法1.菌株收集和药敏实验收集广州医科大学附属第一医院检验科微生物室分离的来自不同科室的不同标本类型的耐碳青霉烯类抗菌药物的肠杆菌科菌株共18株。全部菌株的鉴定及药敏实验采用法国梅里埃Vitek2全自动微生物鉴定仪与药物敏感仪完成,药敏结果按美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100-S22 2012版进行判读。2.菌株DNA模板的制备及多重PCR实验菌株DNA模板的制备采用煮沸法,利用多重PCR方法对所有的菌株进行11种碳青霉烯酶基因blaIMP、blaSPM、blaAIM、blaVIM、blaOXA、blaGIM、blaBIC、blaSIM、blaNDM、blaDIM、blaKPC的检测,阳性PCR产物送公司进行测序验证,所得序列于网上BLAST比对,最终确定其基因亚型。3.耐药基因传播方式研究对所有携带碳青霉烯酶基因的菌株进行质粒接合转移实验并采用法国梅里埃Vitek2全自动微生物鉴定仪与药物敏感仪对接合子进行鉴定和检测药敏,药敏结果按美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100-S22 2012版进行判读。对携带碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌株进行MLST分型,以和国内外已报道的情况进行比较。4.将多重耐药菌株肺炎克雷伯菌(KP)DQ49与受体菌EC600进行接合实验,PCR验证接合成功后,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取接合子基因组DNA,并利用Illumina Miseq高通量测序平台对其进行序列测定,得到的数据用Edena软件拼接,并利用RAST网上注释工具对得到的质粒全序列进行注释,使用网上序列比对工具BLAST进行耐药基因环境分析,使用PlasmidFinder网上工具进行质粒不相容性分析,使用ResFinder网上工具进行耐药基因分析,使用MLST网上工具进行ST分型分析。研究结果1.药敏结果18株耐碳青霉烯类抗菌药物的肠杆菌科细菌中包括肺炎克雷伯菌12株、大肠埃希菌2株、阴沟肠杆菌2株、植生拉乌尔菌1株、弗氏柠檬酸杆菌1株;科室分布为重症监护病房13株、泌尿外科2株、心血管内科1株、肝胆科1株、胃肠外科1株;标本类型为痰7株、中段尿2株、胆汁2株、腹腔引流液2株、插管导管1株、导管头1株、血液1株、分泌物1株、其他1株。经检测,18株菌对碳青霉烯类、青霉素类、β-内酰胺类、单环内酰胺类抗菌药物表现出较强的耐药性,表现为多重耐药;但对氨基糖苷类的阿米卡星、庆大霉素,磺胺类的呋喃妥因、复方新诺明,甘氨酰环素类的替加环素,氟喹诺酮类的环丙沙星、左旋氧氟沙星的耐药性却有不同。2.多重PCR检测碳青霉烯酶基因结果用多重PCR对18株碳青霉烯类耐药菌进行碳青霉烯酶基因检测,发现这些菌株均携带碳青霉烯酶基因,全部送测序,其中8株为blaNDM-1型,8株为blaKPC-2型,1株为blaVIM-1型,1株为bla_(IMP-26)型。3.耐药基因水平传播方式及肺炎克雷伯菌MLST结果在接合实验中,有10株菌成功地将质粒传递给受体菌EC600,其中包括肺炎克雷伯菌7株,大肠埃希菌2株,阴沟肠杆菌1株;8株通过电转化实验成功将质粒转移至受体菌DH5α,其中包括肺炎克雷伯菌5株,阴沟肠杆菌1株,植生拉乌尔菌1株,弗氏柠檬酸杆菌1株。选取12株肺炎克雷伯菌进行MLST分析,其中ST11型有10株,占大部分;ST20型1株;1株为ST2460,为首次报道。4.通过接合实验得到携带耐药基因bla_(IMP-26)的质粒pIMP26_DQ49,对质粒进行全序列测定。测序结果表明,pIMP26_DQ49属于质粒不相容群(Inc)中的IncN群,是大小为55179bp的环状质粒,携带三个耐药基因,G+C含量为50.4%,预测编码52个功能基因。BLAST发现pIMP26_DQ49与已报道的p IMP_HZ1序列相似度高达99%,且携带的可移动基因元件也高度相似,其耐药基因环境包含可导致转座事件发生的IS903D、IS2、Tn2、Tn3、tnp、tnpA,以及能捕获和整合外源性基因的1类整合子基因intI1。结论耐碳青霉烯类抗菌药物的肠杆菌科菌株均携带碳青霉烯酶基因,这些基因均可以通过接合实验或电转化实验在同科细菌间水平转移;肺炎克雷伯菌的质粒p IMP26_DQ49携带超广谱β-内酰胺酶基因blaTEM-1、氟喹诺酮耐药基因qnrS1和金属型碳青霉烯酶基因bla_(IMP-26),其存在可能对耐药基因在肠杆菌科细菌中的传播发挥重要作用。


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