大鼠股骨节段性骨缺损修复中H型血管的作用及机制学研究

【摘要】：1.背景骨缺损一直是骨科的难题,关于其机制研究主要集中在成骨与血管生成相互关联,最近的报道发现小鼠骨组织存在一种特殊血管亚型H型(CD31~(hi)Emcn~(hi))血管,其维持骨内独特的代谢微环境,积极调控骨骼的形成。有研究发现H型血管在骨损伤修复早期(14天)大量出现,相关成骨因子与其密切关联。然而,对于骨内H型血管在整个损伤修复周期,尤其是大段骨缺损下的愈合过程中是否存在作用呢?目前尚未有文献报道。因此,进一步研究H型血管机制作用显得尤为重要,同时对股骨节段性缺损治疗具有重要的指导意义。2.目的2.1用不同浓度去铁胺(Desferrioxamine,DFO)作用于大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchyml Stem Cells,BMSCs)及内皮细胞(Endotheliocyte Cells,ECs),确定最佳的药物浓度,探讨DFO的成骨和血管生成作用;2.2使用明胶微球(Gelatin Microspheres,GMs)载药方法记录药物体外缓释情况,评估进一步体内凝胶载药微球支架修复股骨大段缺损的可行性;2.3构建大鼠骨缺损模型,在缺损处植入不同组凝胶载药微球支架,观察缺损修复情况,H型血管、低氧诱导因子因子-1α(Hypoxia Inducer-1 alpha,Hif-1α)及成骨转录相关因子(Osterix,Osx)时空分布特性,探讨H型血管在股骨节段性缺损修复过程中的作用。3.方法3.1将DFO设计成三个梯度浓度(低浓度30μmol/L,中浓度60μmol/L,高浓度120μmol/L),设磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)对照组(60μmol/L)和DFO+PX-478(Hif-1α抑制剂)组(60μmol/L),观察不同浓度DFO对BMSCs的成骨诱导分化的影响作用。3.2将DFO设计成三个梯度浓度,设置PBS对照组和DFO+PX-478组,浓度同前。观察DFO不同浓度下对ECs的体外成血管作用。3.3使用明胶与橄榄油通过一系列步骤制备得到GMs,载入3组梯度剂量DFO微球(DFO-L-GMs组50mg、DFO-M-GMs组100mg、DFO-H-GMs组200mg),同时制备未载药微球组(Empty)及DFO+PX-478-GMs组(100mg)复合微球。分析该药物缓释系统可行性及效能特性。3.4(1)使用X片、微计算机断层扫描(Micro-Computed Tomography,Micro-CT)分析5组大鼠缺损处修复情况,如新生骨小梁数量、骨密度等;(2)使用苏木精-伊红染色(HE)、马松染色(Masson)、戈德染色(Goldner)分析5组大鼠缺损新生骨组织情况;(3)使用免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)分析5组大鼠H型血管数量,生长状况包括形态、分布等;还分析5组H型血管与Hif-1α及Osx潜在联系;(4)使用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase chain reaction,RT-PCR)分析5组大鼠缺损区Hif-1αmRNA、Osx mRNA表达水平,分析H型血管与二者调控机制特点。4.结果4.1 DFO三组浓度对比PBS组均表现出促进BMSCs成骨诱导分化结果,其中中浓度60μmol/L钙沉积量最多,此外Empty组钙沉积量最少。4.2 DFO三组浓度对比PBS组成血管数量及总长度均更好,其中中浓度60μmol/L成血管数量最多、总长度最长,此外Empty组两个指标在5组中最差。4.3复合DFO及PX-478的明胶微球均制作成功,药物缓释效能较好,最终释放时间平均最少达到19d,药物缓释表现出4个明显阶段:在释放的最初1天内药物爆发性释放,几乎达到总量的35%。最初的爆发释放后,释放速率开始减慢,直到2天后达到几乎平稳的状态。第3天到13天的平稳状态释放量约占总的释放量的8%。最终,在持续释放期过后,药物释放速率开始急剧增加,并在不到5天的时间内释放了约50%的药物。4.4(1)X片显示12周大鼠股骨缺损处DFO-GMs三组均愈合,Empty组及DFO+PX-478-GMs组仍可见缺损,Empty组缺损最大;(2)Micro-CT重建符合X片结果,其中中剂量组(100mg)几乎完全修复,低剂量组(50mg)和高剂量组(200mg)缺损断端连接,表面仍有缺损,DFO+PX-478-GMs组缺损区可见微小缺损不连续,Empty组表现大段不连续,缺损新生骨小梁数量与重建结果相符合,DFO-GMs组骨小梁数量明显多于其余两组(P0.05),其中Empty组数量明显少于DFO+PX-478-GMs组(P0.05),DFO-M-GMs组明显多于DFO-L-GMs与DFO-H-GMs组(P0.05);(3)组织学染色结果显示DFO-GMs组新生骨组织明显多于其余两组(P0.05),其中Empty数量明显少于DFO+PX-478-GMs组(P0.05),中剂量组明显多于低剂量与高剂量组(P0.05);(4)免疫荧光结果显示:4周时DFO-GMs组H型血管数量明显高于其余两组(P0.05),其中Empty组明显少于DFO+PX-478-GMs组(P0.05),中剂量DFO-M-GMs组明显多于低剂量与高剂量组(P0.05),8周时DFO-GMs组H型血管数量明显高于其余两组(P0.05),其中Empty组明显少于DFO+PX-478-GMs组(P0.05),中剂量组明显多于低剂量与高剂量组(P0.05);12周时DFO-GMs组H型血管数量明显高于其余两组(P0.05),其中Empty组明显少于DFO+PX-478-GMs组(P0.05);荧光共定位结果显示:Hif-1α和Osx均主要分布在H型血管周围。RT-PCR显示:DFO-GMs组中Hif-1αmRNA和Osx mRNA明显高于其余两组(P0.05);其中Empty组明显少于DFO+PX-478-GMs组(P0.05),中剂量组明显多于低剂量与高剂量组(P0.05)。5.结论5.1一定浓度的DFO具有体外促BMSCs成骨诱导分化和促ECs成血管的作用,PX-478具有抑制作用。5.2明胶微球可以长期缓慢释放药物,复合药物置入修复骨缺损具有可行性,修复效果优于传统骨组织工程。5.3 DFO可通过刺激Hif-1α表达促H型血管增殖,以H型血管联合生成大量成骨转录因子Osx为中心的高代谢成骨分化区域,可有效促进节段性骨缺损修复。