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利用造血干细胞移植建立人源化β-地中海贫血小鼠模型的研究

陈嘉欣  
【摘要】:【背景与目的】造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是决定造血作用的缔造者,即在生物体生命过程中不断产生的血细胞。HSC因具有能够实现自我更新和分化为多种类型血液细胞的潜能,来自骨髓和其他组织来源的HSC已被应用于治疗获得性或遗传性、恶性和非恶性血液系统疾病、遗传性代谢疾病、血红蛋白病、骨髓增生性疾病和免疫系统疾病等,所以HSC的体外扩增培养一直是生物医学领域的研究热点,然而,当前体外扩增过程中HSC的干性维持仍是个急需解决的问题。UM171和Stem Regenin 1(SR1)分别是嘧啶吲哚类衍生物和嘌呤衍生物,这两个小分子化合物都被认为是安全有效的HSC体外扩增剂。本研究的目的是探究UM171和SR1小分子化合物的各自添加和联合使用对人造血干细胞体外扩增的影响。之后,将HSC体外扩增培养体系与人源化小鼠模型技术相结合,构建与人类地中海贫血疾病相似的人源化小鼠动物模型,该模型对研究贫血性疾病的发病、治疗和预防有重大的意义。【材料与方法】1.材料本研究所用的脐带血和16-23周胚胎均由广州医科大学附属第三医院妇产科产妇捐赠。本研究经广州医科大学附属第三医院医学伦理委员会批准,所有患者或家属均签署临床研究知情同意书。2.方法2.1体外高效扩增CD34~+HSC根据Easy Sep?Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II试剂盒的说明书,经细胞分选仪提取新鲜脐带血样本中的CD34~+HSC。CD34~+HSC的体外基础体系为:Stem Span?SFEM II培养基+干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素(TPO)+酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)+白细胞介素(IL-6)。为探究小分子化合物UM171和SR1在HSC体外培养中的作用,我们建立了4种不同培养体系对CD34~+HSC进行体外培养:对照组(基础培养体系)、SR1组(基础培养体系+SR1)、UM171组(基础培养体系+UM171)、SR1+UM171组(基础培养体系+SR1+UM171)。CD34~+HSC经体外培养5天后,取各组细胞分别进行(1)CFU集落形成实验,观察统计集落形成情况,验证体外培养的CD34~+HSC的多能性维持情况和(2)流式细胞分选鉴定HSC特异性标记物CD34和CD133的表达情况,用以筛选最佳培养体系。收集该培养体系培养下的细胞,根据CD34和CD133的表达差异细分为H组(CD34~+CD133~(high))、L组(CD34~+CD133~(low))、N组(CD34~+CD133~(neg))并进行流式分选。富集到的三组细胞进行进一步两两组合,每组分别取5×10~5的细胞量,继续分组,即H+H组,L+L组,N+N组,H+L组,L+N组,H+N组,另加一组1×10~6的未经流式分选的体外培养五天的细胞作为对照组,用以研究CD34~+CD133~(high)细胞群对HSC增殖和干性的影响。在最佳培养体系下培养5天后,再次进行流式细胞实验分析CD34,CD133的表达情况,验证添加小分子化合物结合细胞分群后,体外HSC的增殖及干性维持情况。2.2构建人源化地中海贫血症模型小鼠提取含CD41-42(-CTTT)纯合突变的重型β-地中海贫血胎儿肝脏中的CD34~+HSC。之后,将CD41-42(-CTTT)纯合突变胎肝来源的人CD34~+HSC和正常脐带血来源的人CD34~+HSC分别经尾静脉注射入免疫缺陷小鼠体内。在这里,我们用的是维通利华的NOG-EXL小鼠,其专业名称为NOD.Cg-Prkdc~(scid)Il2rg~(tm1Sug)Tg(SV40/HTLV-IL3,CSF2)10-7Jic/Jic,优点是hu HSC-CD34+移植后,不仅可以分化出淋巴细胞,还可以分化出多种髓系细胞(粒细胞,单核细胞,巨噬细胞等),是目前免疫系统人源化最完全的模型。相较于基础NOG/NSG,hu HSC-CD34+移植后,人源免疫系统重建率更高。将正常脐带血来源的人CD34~+细胞作为对照组,纯合β-地中海贫血胎肝来源的CD34~+细胞作为实验组。分别于移植后8周和12周,对小鼠进行取材,检测外周血中人CD45~+细胞和鼠CD45~+细胞所占的比例。分离提取检测后各组小鼠的骨髓中的CD34~+HSC,对其进行二次尾静脉注射移植入免疫缺陷小鼠体内,移植12周后,再次检测小鼠外周血中人CD45~+细胞和鼠CD45~+细胞所占的比例,验证人源化小鼠模型的构建情况。【结果】(1)脐带血来源的人HSC体外培养5天后,细胞计数统计结果个数显示:与对照组(5.86±2.04×10~6),UM171组(7.22±2.42×10~6),SR1组(10.31±1.23×10~6)相比,UM171+SR1组(14.05±2.05×10~6)的细胞扩增的数量最多。(2)脐带血来源的人HSC体外培养5天后,经流式细胞仪检测细胞CD34和CD133表达情况显示:UM171组(62.47±4.99%),SR1组(60.58±5.36%),UM171+SR1组(65.93±4.31%)的CD34~+CD133~+占比均显著高于对照组(40.37±6.32%)。(3)脐带血来源的人HSC体外培养5天后,CFU集落形成结果个数显示:对照组(88.17±9.73),UM171+SR1组(81.17±6.85),UM171组(69.67±8.38)的集落形成数目均显著多于SR1组(43.33±4.13)。(4)第一次HSC移植8周后,免疫缺陷小鼠的外周血检测结果显示:脐带血来源的HSC移植后,外周血中人CD45~+细胞比例在47.69%至73.85%,鼠CD45~+细胞比例在26.15%至52.31%;胎肝来源的HSC移植后,外周血中人CD45~+细胞比例在43.91%至54.57%,鼠CD45~+细胞比例在45.43%至56.09%。(5)第一次HSC移植12周后,免疫缺陷小鼠的外周血检测结果显示:脐带血来源的HSC移植后,外周血中人CD45~+细胞比例在49.58至60.31%,鼠CD45~+细胞比例在39.69%至50.41%;胎肝来源的HSC移植后,外周血中人CD45~+细胞比例在52.92%至75.95%,鼠CD45~+细胞比例在24.05%至47.08%。脐带血来源的骨髓中人CD235a~+为20.05%,14.79%,9.43%。胎肝来源的骨髓中人CD235a~+糖蛋白细胞比例为28.59%,17.76%。(6)第二次HSC移植12周后,免疫缺陷小鼠的外周血检测结果显示:脐带血来源的HSC移植后,外周血中人CD45~+细胞比例在0.09%至49.53%,鼠CD45~+细胞比例在50.47%至99.91%;胎肝来源的HSC移植后,外周血中人CD45~+细胞比例在73.93%至82.99%,鼠CD45~+细胞比例在17.01%至26.07%。脐带血来源的中人CD235a~+为0.13至0.18%。胎肝的骨髓中人CD235a~+为16.20%至22.81%。【结论】(1)人HSC的体外培养和扩增过程中,同时添加SR1和UM171可以促进CD34+CD133+细胞群的增殖以及干性维持。(2)CD34+CD133high细胞群对于造血干细胞的数量增殖和干性维持至关重要。(3)将CD41-42(-CTTT)纯合突变胎肝来源的人HSC移植至免疫缺陷小鼠后,获得了具有一定人源化水平的β-地中海贫血模型小鼠。


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