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构建椎体后凸成形术新型骨填充材料的相关研究

刘青华  
【摘要】: 背景:随着全球人口的日益老龄化,老年骨质疏松症越来越受到关注,是老年人常见病、多发病,临床表现为疼痛、身长缩短、驼背、骨折、呼吸功能下降等,据估计我国目前有骨质疏松症患者90百余万, 2015年将达110百万。骨量减少,骨微结构退化和骨脆性增加是其三大特点,常导致多种并发症发生,其中最严重的是椎体压缩性骨折(Vertebral Compressive Fracture,VCF),即骨质疏松性椎体压缩骨折(osteoporotic vertebral compression fracture, OVCF) ,在绝经妇女发生率达16%, 70岁以上老年人为20%。因缺乏有效的治疗手段,导致患者生活质量急剧下降,引发各种并发症;病变晚期伤椎进一步压缩,疼痛及后凸畸形明显加重,导致胸腔容积缩小引起心肺功能障碍,甚至死亡。传统外科手术具有较大创伤性或因病人特殊情况而无法手术。目前在经皮椎体成形术(percutaneous vertebroplasty ,PVP)基础上发展完善的经皮球囊扩张椎体后凸成形术(percutaneous kyphoplasty,PKP)已成为世界公认的、对此有效的标准治疗手段,但在越来越多的应用中发现:(a)术中低压灌注的骨水泥(PMMA)在固化时产热和毒性可引起心跳骤停和脊髓、神经根的损伤:(b)骨水泥易渗漏而引起血管栓塞和肺栓塞;(c)骨水泥不能降解,生物相容性差,从而造成永久性异物残留;(d)病椎日后再骨折时难以处理,远期疗效不明显。在一定程度上限制了此项先进治疗手段的推广应用。 因此,研制一种生物相容性好、安全性能高、能替代普通骨水泥(PMMA)的新型骨填充材料必然成为老年骨质疏松椎体压缩骨折治疗的一大趋势。根据组织工程学原理采用骨髓间质干细胞(BMSCs)与复合骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的新型可注射可降解磷酸钙骨水泥(CPC)构建一种具有一定生物力学强度、良好生物活性,可注射可降解的组织工程化骨,作为经皮椎体后凸成形术理想的填充材料,是当今骨组织工程领域研究的一大方向。本研究主要针对BMSCs的体外分离培养和生物学特性、CPC的生物相容性及与BMSC共培养等方面进行研究,本实验结果将为椎体后凸成形术理想填充材料的研制提供新的科学依据。 目的: 1、寻找简单可靠的方法对人骨髓间充质干细胞进行体外分离培养与鉴定,并研究其生物学特性和诱导分化条件,为骨组织工程研究提供大量种子细胞; 2、评价新型可注射可降解磷酸钙骨水泥的细胞相容性,为体外构建和体内实验提供理论依据; 3、探讨新型可注射磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞共培养的可行性,为组织工程化骨的构建提供科学依据。 方法: 1、取少量健康人骨髓采用Pecoll分离液进行密度梯度离心获得单个核细胞,用含10%FBS的L-DMEM经贴壁培养法分离纯化、扩增获得大量hBMSCs,观察细胞形态、生长特性并经流式细胞仪鉴定;分别以成骨诱导液和BMP-2诱导细胞成骨; 2、采用浸提法制备CPC浸提液,加入到人骨髓间充质干细胞的培养体系中,MTT法测定细胞相对增殖率,进行细胞毒性反应分级;流式细胞仪检测CPC浸提液培养的hBMSCs的细胞周期;将肝素抗凝的新鲜健康人血用生理盐水稀释成2%的人血悬液,在离心管中分别加入CPC生理盐水浸提液(浸提液原液组、50%原液组)、生理盐水(阴性对照组)和双蒸水(阳性对照组), 37℃水浴60 min,用分光光度计测定吸光度值,计算红细胞溶解率;将浸提液5ml缓缓注入新西兰白兔的耳静脉,记录其体温值; 3、将新型磷酸钙骨水泥在不同凝结时间分别加入到BMSC浓度为1×107/L的6孔培养板中,逐日观察材料边缘细胞贴壁生长情况,培养一周后扫描电镜观察;取第三代BMSC,将密度调至1×107/L加入到12孔培养板,注入糊状磷酸钙骨水泥(成团期),分别于培养1天、3天、5天、1周终止培养进行扫描电镜观察。 结果: 1、经密度梯度离心贴壁培养法可较易扩增、获得大量高纯度的BMSC,其细胞形态、分化特性和表型均符合干细胞特点,并能在特定培养条件下(OS或BMP-2)向成骨细胞分化。 2、新型磷酸钙骨水泥的细胞毒性反应为0~Ⅰ级,基本无毒性;对人血的溶血率5%,即无体外溶血作用;白兔体温波动1°C,无明显致热作用。 3、光镜下见细胞在大部分组的CPC材料边缘生长良好,未见细胞变形、坏死;扫描电镜观察见大量细胞紧贴材料生长,细胞生长良好,细胞呈不规则的多角形、近圆形,在骨水泥表面与其他细胞相连融合成片。 结论: 1、BMSCs取材方便、对机体创伤小,分离扩增容易,利用密度梯度离心+贴壁培养法可获得大量高纯度的BMSCs;细胞增殖能力好,定向诱导分化技术成熟,成骨诱导简便易掌握且成骨性能良好,是适合骨组织工程研究的理想种子细胞。 2、新型可注射性磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性,符合体内植入材料的细胞毒性要求,不会对机体造成明显的不良影响,可以向临床应用过渡。 3、骨髓间充质干细胞能够在常规培养体系中与新型可注射可降解磷酸钙骨水泥共培养,可进行下一步的动物体内组织工程化骨构建实验。


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