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抗岩沙海葵毒素单克隆抗体的制备以及鉴定

戴悦婵  
【摘要】: 目的:岩沙海葵毒素(Palytoxin, PTX)是目前已知毒性最强烈的海洋生物毒素之一,具有作用于神经、肌肉的电压门控钠通道,改变通道的功能,以及对细胞毒性、溶血等多方面的影响。人类在进食经PTX污染的食物后,可导致严重的肌肉疼痛、腰痛、排黑尿等症状,甚至死亡。而目前在我国乃至全球仍未研究出一种针对该毒素的治疗药物,因此PTX的存在对人类的健康安全构成相当大的威胁。 本课题通过化学方法制备出PTX的人工抗原,将其与弗氏佐剂混合后对BALB/c小鼠进行免疫,产生抗PTX抗血清,并以较为成熟的单克隆抗体杂交瘤技术,建立分泌岩沙海葵毒素的高特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。该细胞株的建立为日后在实际工作中对PTX的检测提供有利的工具。 方法:本课题分三部分进行: 1.抗PTX的抗血清的制备 将PTX与载体蛋白KLH、BSA偶联成具有免疫功能的PTX-PDP-KLH免疫抗原和PTX-PDP-BSA检测抗原。用PTX-PDP-KLH免疫雌性6~8周龄BALB/c小鼠,采用眼眶后静脉丛取血获得抗PTX抗血清,对其效价进行间接ELISA法检测,以健康BALB/c小鼠血清为对照组。 2.分泌抗岩沙海葵毒素McAb的杂交瘤制备 将能分泌出抗PTX抗血清的免疫小鼠脾脏细胞通过传统杂交瘤技术与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合,并通过间接ELISA方法筛选克隆阳性杂交瘤细胞株,阳性细胞对其扩大培养并冻存。 3.抗岩沙海葵毒素单克隆抗体的检测及生产 将成功分泌抗PTX单克隆抗体的融合细胞进行核型分析、特异性分析后,注射进健康BALB/c小鼠体内,14天左右产生腹水。腹水经硫酸铵沉淀、透析、rProteinA亲和层析等方法纯化后得到腹水型抗体。 结果: 1.利用连续紫外分光光度计检测出在267 nm时偶联物PTX-PDP-KLH出现峰值,而PTX-PDP-BSA在273 nm时出现峰值。将PTX-PDP-KLH对BALB/c小鼠进行皮下、腹部多点免疫,以PTX-PDP-BSA作为检测抗原进行包被,对其抗血清进行ELISA检测,所得结果发现注射了免疫抗原的小鼠抗血清与对照组有明显差别(1: 2500时OD7)。 2.杂交瘤细胞融合率为21.43 % ,其阳性克隆率为9.1 % ,经过间接ELISA方法反复筛选,获得能稳定分泌抗PTX单克隆抗体的杂交瘤细胞株A6和B8。 3.核型分析发现,抗PTX单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体数目在94~104之间,特异性检测中PTX与载体蛋白KLH、BSA没有发生交叉反应,显示该抗体为抗PTX的特异性抗体。细胞免疫小鼠后产生4~5 ml的腹水,经过分离纯化后,SDS-PAGE分析表明,抗PTX单克隆抗体细胞株在50 kD和25 kD处各出现一条蛋白条带,与IgG的重链和轻链的大小相符。 结论:1.本研究通过化学方法成功将PTX和载体蛋白KLH、BSA偶联,克服了PTX因分子量小而无法刺激机体产生抗体的因素,偶联后的PTX-PDP-KLH具有免疫原性,从而诱导小鼠产生抗PTX抗血清。 2.通过杂交瘤技术获得A6和B8两株能稳定分泌抗PTX的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该细胞株分泌的单克隆抗体可与PTX特异性结合,为PTX的鉴定和检测提供坚实的基础。


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