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银翘柴桂汤HPLC指纹图谱及其体外抑制流感病毒作用研究

何建雄  
【摘要】:银翘柴桂方是广州中医药大学第一附属医院治疗流感的临床验方,由金银花、连翘、柴胡、桂枝等多味药组成,方中金银花、连翘为君药;柴胡、黄芩、重楼、玄参四者共为臣药;桂枝、白芍,二者为佐药;桔梗、麻黄、甘草为使药。具有调营卫、解表邪、畅枢机的的功效,临床上用于治疗流行性感冒而引起的恶寒、发热、头痛、肌肉酸痛、口干、咽痛等症,效果良好。本研究运用指纹图谱分析技术,结合体外抗流感病毒实验探讨银翘柴桂汤作用物质基础,为其颗粒剂的开发提供有益参考。 目的:建立银翘柴桂汤指纹图谱分析方法及指标成分测定方法,从定性定量的角度检测银翘柴桂汤的内在质量,获取汤剂中所含的化学成分信息。在指纹图谱分析的基础上,结合H5N1禽流感假病毒的体外抑制实验,初步明确银翘柴桂汤中可能具有抗流感病毒作用的化学成分及部位。 方法:1.采用HPLC法建立银翘柴桂汤中指标成分(绿原酸、芍药苷、连翘酯苷A和黄芩苷)含量测定方法;2.采用HPLC-DAD及多波长融合技术建立银翘柴桂汤指纹图谱,同时建立银翘散和柴胡桂枝汤这两个相关复方的指纹图谱,采用中药色谱相似度软件对指纹图谱进行评价。3.采用体外试验,检测银翘柴桂汤不同配伍组合、不同部位及主要化学成分对H5N1禽流感假病毒活性的抑制作用。方法是在PCDNA3.1基础上构建的表达质粒pHA-H5和pNA-N1,将这两个质粒同时与一个表达荧光素酶但包膜蛋白、Rev基因缺陷的HIV骨架质粒,采用磷酸钙法共同转染293T细胞,8-16小时后换液,继续培养48小时,收获上清作为H5N1假病毒。将药物与MDCK细胞孵育,然后加入H5N1假病毒,培养48小时后,细胞裂解液裂解细胞,用荧光素酶检测试剂盒,在多功能微孔板分析仪上检测化学发光值,计算药物的对病毒的抑制活性。 结果:1.利用DAD检测器在不同波长检测,在40分钟内同时测定银翘柴桂汤的绿原酸、芍药苷和黄芩苷3个主要成分的含量,实现多类组分、多个成分的同时定量测定,提高了效率,并且其准确度和精密度均符合要求。10批银翘柴桂汤中绿原酸、芍药苷、黄芩苷和连翘酯苷A的含量分别为0.2532~O.3344mg/ml,0.2326~0.7958mg/m1, 0.1081~0.2226mg/m1和0.07986~0.1867mg/m1,不同批次间成分含量有一定差异。2.建立了银翘柴桂汤指纹图谱,10批银翘柴桂汤指纹图谱相似度大于0.9,指纹图谱方法有较好的专属性、稳定性和重复性。在90分钟内,图谱中的指纹峰呈整体分散分布,特征性明显。所得到的指纹图谱有22个共有峰,鉴定了5个峰所属的化学成分,其中4号峰为绿原酸,7号峰为芍药苷,10号峰为甘草苷,14号峰为连翘酯苷A,17号峰为黄芩苷;并对指纹图谱共有峰进行了药材归属分析,其中7个峰来自黄芩,6个峰来自金银花,白芍有3个峰,连翘、桂枝有2个特征峰,甘草有1个特征峰。1号峰为金银花、连翘和白芍峰的叠加。通过“整合法”得到的银翘柴桂汤双波长融合指纹图谱,与原来230nm单一波长下得到的图谱相比,特征峰个数和响应强度都明显增加,信息量更为丰富,能更为全面地反映汤剂的内在化学成分特征。3建立了银翘散和柴胡桂枝汤指纹图谱,结果显示组成银翘柴桂汤的共有药材图谱与原方汤剂的指纹图谱相似性较高,从化学成分角度表明这些药材能充分体现原方的特性,说明了从银翘散、柴胡桂枝汤中选取这些药材组成银翘柴桂汤具有一定的合理性。4 H5N1禽流感假病毒的体外抑制实验结果表明:银翘柴桂方中君药、臣药有一定的抑制H5N1假病毒的作用;汤剂经AB-8大孔吸附树脂吸附,95%乙醇洗脱部位对H5N1假病毒有抑制作用,IC50为0.08854mg/ml;汤剂中所含的绿原酸、芍药苷、黄芩苷和连翘酯苷这四个主要化学成分对H5N1假病毒几乎没有抑制作用。 结论:银翘柴桂汤指纹图谱及指标成分含量测定方法稳定性、精密度、重现性符合要求;君药、臣药的化学信息对汤剂指纹图谱的贡献最大,药效结果表明两者在复方治疗流感的作用中可能起主要作用;汤剂不同部位抗流感实验结果表明弱极性部位的作用效果较强,对银翘柴桂颗粒剂制备工艺研究过程中提取方法的选择有很好的指导意义;银翘柴桂汤中绿原酸、芍药苷、连翘酯苷和黄芩苷等4个主要化学成分的药效实验结果表明,其在体外没有抑制H5N1假病毒的作用,可能这些成分在体内是通过改善机体症状或提高机体免疫力,从而起到治疗流感的作用的,这需要通过进一步的研究论证。


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