消积饮维持治疗晚期肺癌及其对PI3K/AKT/mTOR信号通路影响的研究

【摘要】：研究背景： 肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一,并成为目前人类因癌症死亡的主要原因,是对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。PI3K/AKT/mTOR信号通路在肺癌的发生发展中起着重要的作用,该通路的活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡,促进细胞周期进展,从而促进细胞的生长和增殖,同时参与血管形成,在肺癌的形成中扮演重要角色,并参与肿瘤的侵袭和转移。 维持治疗作为延长肺癌患者长期生存的新的重要手段,已引起临床医生的极大重视。晚期非小细胞肺癌的维持治疗临床研究表明,患者经过4-6周期含铂类药物的一线标准联合化疗方案后,疾病无进展且体力状况良好,选择毒副作用较小的药物如细胞毒单药维持化疗或分子靶向药物进行维持治疗可使晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者受益。而中药在维持治疗晚期非小细胞肺癌的领域中的研究尚为数不多,基于长期化疗药物及分子靶向药物维持治疗的毒副反应,中医药可发挥自身优势,探索最佳维持治疗方案。 消积饮作为广东省中医院名老中医刘伟胜教授的多年经验方,已取得了良好的临床疗效,同时亦有多个实验证明该药能够抑制小鼠Lewis肺癌的生长和自发性肺转移、延长荷瘤小鼠的生存期,其作用机制与消积饮降低小鼠Lewis肺癌细胞cyclinDl的表达,影响其细胞周期G1/S调控点,有效地阻止肿瘤细胞周期于G0、G1期,使其不能进入S期进行DNA复制有关。此外,消积饮能有效下调肿瘤细胞PCNA(增殖细胞核抗原)、survivin蛋白及bcl-2基因的表达强度,诱导肿瘤细胞凋亡,降低其转移潜能,从而稳定病灶、减少转移。研究目的： 为探索一条中药维持治疗晚期肺癌的治疗方案,同时深层次挖掘名老中医的学术内涵,从PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨消积饮抑制肺癌生长的分子机制亟待进一步研究。 研究内容与方法： 1临床部分 根据纳入标准选入64例经4～6周期化疗后1个月以上,RECIST评价稳定的ⅢB及Ⅳ期NSCLC患者,入组前患者卡氏评分≥60分,无脑转移或脑转移无症状,骨髓、心、肝、肾功能正常。按信封法随机分为治疗组和对照组各32例,治疗组给予消积饮(60ml/m2, po, qd)维持治疗,对照组给予支持治疗,治疗3月后对照统计两组维持治疗的有效率(CR+PR+SD)、临床证候及体力状况、疾病无进展生存期(PFS)及总生存期(OS)。治疗组评价无疾病进展继续治疗及随访观察至疾病进展或死亡。应用SPSS12.0统计分析软件,组间临床特征均衡性评估采用方差分析和PearsornX2检验；组间OS、PFS比较采用Kaplan-Meier分析；治疗后临床证候、体力状况评分取治疗后评估分。组间症状缓解率、体力状况比较采用两个独立样本Mann-Whitney U Test。安全性评价采用描述性统计。 2实验部分 选取人A549肺癌细胞株作为研究对象,生长于RPMI-1640培养液中,细胞传代24h进入对数生长期后分别加入低浓度、中浓度、高浓度含药血清(含消积饮的大鼠血清)及胎牛血清对照组进行细胞诱导。MTS法测定消积饮对A549细胞增殖的抑制作用,Western Blot印迹法检测PI3K/AKT通路p-AKT蛋白的表达,RT-PCR法检测含药血清对PI3K/AKT通路下游分子BAD、Caspase-9、FKHR等基因的mRNA的表达。应用SPSS12.0统计分析软件,组间对照采用单因素方差分析和t检验。 研究结果： 1临床部分 1.1临床特征 64例PSO-2的ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者均来自于广东省中医院肿瘤科住院部,患者于2008年9月到2010年12月纳入研究,治疗前两组基线资料,性别、吸烟史、年龄、分期、KPS评分、入组前化疗等差异均无显著性,组间分布均衡(P0.05)。共4例出组,治疗组2例因未完成既定治疗出组,对照组2例因主观违背治疗方案出组。实际可评价疗效病例60例,已死亡41例,其余19例正在随访中,按预期计划,经统计学样本数估算,符合疗效评价要求。 1.2近期疗效 治疗3个月后疗效评估,消积饮治疗组有效率达76.7%,对照组有效率达43.3%,两组之间相比具有显著差异(P=0.00)。 1.3生存时间 截止最后随访时间,治疗组和对照组OS分别为6.43个月和3.27个月,组间比较,治疗组的OS延长了3.16个月,两组有明显差异(P=0.00)；治疗组和对照组PFS分别为5.07个月和2.53个月,组间比较,治疗组的PFS延长了2.54个月,两组有明显差异(P=0.00)。 1.4临床证候评分 治疗3个月后,与对照组比较,治疗组临床证候评估改善率提高了43.3%,差异有统计学意义(Z=2.362,P=0.009)。1.5体力状况 治疗3个月后,与对照组比较,治疗组体力状况改善率提高了26.6%,差异有统计学意义(Z=2.128,P=0.033)。 1.6安全性评价安全性评价表明受试者服用消积饮前后血常规,肝、肾功能及心电图检查均未见明显变化。按WHO《实体瘤疗效评定标准和急性和亚急性毒副反应评定标准》,本组病例中没有出现因为不能耐受不良反应而出组的情况。未见相关血液学毒性。未见明显呕吐、腹泻等胃肠道症状、脱发及严重的心、肝、肾功能损害。治疗组3例受试者第2天出现恶心,按WHO毒性分级1级,未经处理,持续约10min,后症状消失；1例受试者服药后约30min出现轻度腹泻,未经处理自行缓解。未出现与治疗相关的死亡。 2实验部分 2.1 MTS法检测含不同浓度消积饮血清对细胞增殖影响的研究 不同浓度的消积饮血清均可抑制人A549肺癌细胞的增殖；高浓度消积饮血清培养人A549肺癌细胞72小时增殖抑制率与对照组相比具有显著差异。 2.2消积饮调控人肺癌细胞p-PI3K/p-AKT/mTOR基因表达的研究 人A549肺癌细胞中加入不同浓度的消积饮血清作用48小时、72小时后记录基因表达量,结果示BAD、Caspase-9基因mRNA的表达量明显增加,作用48小时的高浓度消积饮组2-△△Ct较对照组明显升高,并具有统计学意义(P0.01)；各实验组之间比较无明显差异。同时,mTOR、NF-κB、FKHR基因mRNA的表达量也明显增加,较对照组也具有统计学意义(P0.01)；各实验组之间比较无明显差异(PO.05)。2.3 Western Blotting检测消积饮对PTEN、PI3K及p-AKT蛋白表达的影响 经图像处理分析,以GAPDH的灰度值为参照,PTEN、P13K、磷酸化AKT的蛋白表达减少,PI3K的蛋白表达量增加；其中低、中浓度消积饮组可使p-PTEN表达下调,与对照组相比有明显差异(P0.01)；低、高浓度消积饮组可使P-PI3K表达上调,与对照组相比有明显差异(P0.01)；中、高浓度消积饮均可使磷酸化AKT蛋白表达水平下调,与对照组相比具有统计学意义(P0.01)。 研究结论： 1临床部分 本研究通过前瞻性随机对照试验,消积饮治疗组的有效率较对照组明显升高,中位生存时间及疾病无进展时间较对照组明显延长,临床证候与体力状况较对照组明显改善,毒副反应轻微,安全性评价高。因此,消积饮作为晚期非小细胞肺癌的中药维持治疗方案具有有效低毒的优势,可使晚期NSCLC患者的生存时间及生活质量获益。 2实验部分 消积饮含药血清可在体外有效抑制人肺癌细胞株A549细胞的增殖,具有一定的细胞毒性作用；消积饮可有效抑制PI3K/AKT信号转导通路的AKT位点,增加PI3K/AKT信号转导通路的下游分子BAD、Casepase-9基因mRNA的表达,促进A549肺癌细胞的凋亡,从而有效抑制A549肺癌细肺癌的生长。