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龟板有效成分对血清饥饿诱导的PC12细胞凋亡的影响及其分子机制研究

曹佳会  
【摘要】:一、研究目的 帕金森病(Parkinson's disease, PD)多发于中老年人,随着人口老龄化进程的加快,它严重影响着中老年人的生活质量,亦是致残的主要原因之一。PD主要病理特征是黑质和纹状体多巴胺能(dopamine, DA)神经元选择性死亡和缺失,而DA神经元产生减少导致了基底节神经调节功能的紊乱。尽管PD发病与遗传、环境、年龄老化、氧化应激、免疫炎症等多种因素有关,但有证据表明DA神经元凋亡是各种因素导致PD发生的共同途径,DA神经元变性的最后步骤,是黑质神经元变性的主要原因。因此,寻找能有效发挥神经保护作用的药物对于PD的防治具有深远的意义。 根据中医学“肾生髓,通脑”学说,由龟板为主组成的许多经典名方应用于临床治疗神经系统疾病。现代医学研究证明,龟板及其乙酸乙酯部位提取物(龟板提取物,Plastrum Testudinis Extracted with ethyl acetate, PTE)能上调BMPs信号分子表达,进而对6-羟基多巴胺诱导的PD模型具有明显的神经保护作用。另外,研究发现PTE中含有9个化合物,但是究竟哪种(些)化合物发挥了神经保护作用仍不清楚。因此,本研究拟采用血清饥饿法诱导PC12细胞凋亡,进一步分析探讨PTE及其组成化合物的抗凋亡效应及其潜在机制。 二、研究方法 (一)观察PTE的抗凋亡效应以及其机制 (1)采用血清饥饿3天的方法建立PC12细胞凋亡模型,并将细胞分为对照组、模型组、PTE(3μg/ml)及PTE(30μg/ml)共四组,对照组不做任何处理,模型组以及药物组使用无血清培养,药物组加入不同浓度的PTE,模型组加入与药物组相同的DMSO。在施加处理因素后,使用MTT法分析测定PC12细胞吸光度值,光学显微镜观察其形态,Annexin-V/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡核形态观察PTE对血清饥饿诱导PC12细胞凋亡的影响。 (2)使用Dioc6标记流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,Western blot检测Caspase-3分子的表达,分析线粒体通路在PTE抗PC12细胞凋亡中的作用。 (3)研究BMPs信号通路是否介导PTE抗血清饥饿诱导的PC12细胞凋亡效应,使用Western blot检测BMPs信号通路分子的表达,用Bio-Rad Quantity One凝胶分析系统对条带进行半定量分析。使用Annexin-V/PI双染流式细胞术检测阻断或激活BMP4信号通路后PC12细胞的凋亡情况,分析PTE的抗凋亡作用。 (二)探讨PTE中何种化学成分具有抗凋亡效应及其分子机制 (1)采用血清饥饿3天的方法建立PC12细胞凋亡模型,并将细胞分为对照组、模型组以及药物组(30以及100μg/ml的十四酸甾醇酯、十六酸甲酯、十八酸乙酯、十八酸、甾酮、胆固醇),用MTT比色分析法测定细胞吸光度值,光学显微镜观察细胞形态,Annexin-V/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率分析何种化合物具有抗血清饥饿诱导凋亡的能力。 (2)转染Idl启动子报告质粒,采用双荧光素酶报告系统检测十四酸甾醇酯作用不同浓度、不同时间对PC12细胞中Idl启动子活性的影响,以及使用BMP4中和抗体阻断BMP4信号后十四酸甾醇酯对Idl启动子活性的影响。采用Western blot以及RT-PCR技术检测BMPs信号通路、Id1、Bcl-x/L等分子的表达,用Bio-Rad QuantityOne凝胶分析系统对条带进行半定量分析。采用Annexin-V/PI双染流式细胞术检测BMP4信号通路阻断后十四酸甾醇酯的抗凋亡作用。 三、研究结果 (1)MTT与光学显微镜观察结果显示,PTE能提高PC12细胞活性,并呈剂量依赖性。Hoechst 33258染色结果以及Annexin-V/PI双染流式细胞术检测结果发现,PTE呈剂量依赖性的降低PC12细胞凋亡率。 (2) Dioc6标记流式细胞术检测结果发现,模型组线粒体膜电位与空白对照相比明显下降,PTE组与模型足相比能明显升高细胞线粒体膜电位。Western blot结果显示,PTE能降低Caspase-3表达,并呈剂量依赖性。 (3) Western blot结果显示,PTE能增加BMP4、BMPRIA、p-Smadl/5/8的表达。PTE对BMP2、BMP7、BMPRⅡ的表达没有影响,BMPR-IB没有被检测出。Annexin-V/PI双染流式细胞术结果发现,BMP4中和抗体部分减弱PTE的抗凋亡活性,转染BMP4质粒过表达BMP4信号通路后放大了PTE的抗凋亡能力。 (4)MTT检测结果表明,PTE中只有十四酸甾醇酯能抑制血清饥饿诱导的PC12细胞凋亡模型的活性下降,十六酸甲酯、十八酸乙酯、十八酸、甾酮、胆固醇对其活性没有影响。Annexin-V/PI双染流式细胞术结果发现,十四酸甾醇酯能抑制血清饥饿诱导的PC12细胞凋亡,并呈剂量依赖性。 (5)双荧光素酶报告检测系统结果表明,十四酸甾醇酯能增加PC12细胞中Idl启动子活性,且这种效应呈剂量和时间依赖性。与十四酸甾醇酯结构相似的化合物十八酸乙酯、甾酮、胆固醇等不能增加PC12细胞中Idl的启动子活性。Western blot和RT-PCR结果表明,十四酸甾醇酯能上调BMP4、BMPRIA的表达,Western blot结果还发现十四酸甾醇酯能上调pSmad1/5/8的表达。十四酸甾醇酯对BMP2、BMPRⅡ的表达没有影响,BMPR-IB没有被检测到。BMP4中和抗体减弱了十四酸甾醇酯增加Idl启动子活性的能力,并且减弱了十四酸甾醇酯的抗凋亡能力。 四、研究结论 PTE具有抑制血清饥饿诱导PC12细胞凋亡的作用,且这种作用呈剂量依赖性,其作用机制与(部分)激活BMP4信号通路,从而抑制下游线粒体凋亡通路有关。PTE含有9种化合物,只有十四酸甾醇酯能抑制血清饥饿诱导的PC12细胞损伤,通过构效关系分析,证实甾酯是发挥抗凋亡作用的活性结构。十四酸甾醇酯发挥抗凋亡活性与(部分)激活BMP4一Id1信号通路有关,甾酯是十四酸甾醇酯增加Idl活性的有效结构。


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