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新型试剂红细胞保存液研究

赖科  
【摘要】:【目的】输血前的血型血清学实验是保证输血安全最基础也是最为重要的实验项目。血型血清学实验离不开抗原抗体反应。血型血清学中所用到的试剂抗体由于生产纯化便利,早已大量商品化标准化。而作为反应体系中另外的一个重要组成部分的红细胞,其作为试剂所面临的问题就要复杂得多。首先红细胞必须来自于人体,无法用其他来源的物质替代。其次血型相关抗原多样且复杂,迄今为止人类已知的红细胞血型已经有29个系统之多。 红细胞作为人体内一种极其重要的细胞,其主要机能是运输氧和二氧化碳。胞质内的血红蛋白由珠蛋白和血红素构成。血红蛋白是红细胞中担负气体运输的功能蛋白。红细胞由红骨髓生成,发育成熟后进入血液循环,平均寿命120天。 因此试剂红细胞生产及保存一直是相关实验室实验人员关注的问题。尤其针对一些稀有血型红细胞,在人群中出现频率低,且不易鉴定,不易收集。再加上不能长时间保存,对血型血清学相关实验的顺利开展都有很大的制约作用。 根据马恩普等报道的在保存液中加入抗氧化剂SOD(超氧化物歧化酶)使ACD(A:枸橼酸、C:枸橼酸三钠、D:葡萄糖)和CPD (C:枸橼酸三钠、P:磷酸盐、D:葡萄糖)保存液保存红细胞的时间从35天提高到75天。但研究只是向输血用的红细胞中添加,由于各种原因,此方法仍处于实验室研究验证阶段,尚未应用于临床。而此前也未有将抗氧化剂应用于试剂用红细胞保存液的研究。超氧化物歧化酶(SOD、国际生化委员会编号:1.15.1.1)是一种生物活性蛋白质,是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂,底物是不稳定的自由基。这种酶对于需氧细胞的存活是至关重要的,它可以催化清除超氧自由基,也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶,所以在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡中起极其重要的作用,对呼吸细胞的存活是至关重要的。 目前试剂红细胞的保存液的研究主要从两方面考虑:一是保护细胞的能量产生机构,使其维持正常结构和功能;二是尽量减慢细胞代谢速度,减少能量消耗并供应能量物质。为方便日常实验使用,试剂用红细胞最为普遍的保存方式是4℃冷藏保存,此种保存方式是将红细胞悬浮保存于液体中。低温保存的优越性主要在于,减慢了红细胞代谢,有利于延长保存时间。且由于血液成分非常有利于微生物生长繁殖,低温保存也可以有效抑制微生物的生长,从而减轻了由于微生物污染生长代谢导致的红细胞破坏,且不会因为反复冻融而使红细胞胞膜破碎溶血。如何长期保持珍贵的作为试剂使用的红细胞,就是我们本次研究的最基本的目的。本研究目的就是研究新型的应用于实验室的试剂红细胞4℃保存液。 【方法】以目前较为经典的GZB试剂红细胞4℃保存液,LP(长效)试剂红细胞保存液,SAN试剂红细胞保养液,首先通过对比实验,找到性能较为优秀的经典配方,再通过筛选实验对此配方进一步改良。作为此次研究的基础配方。在保存期内定期用邻-甲联苯胺法测定以上述保存液稀释的红细胞液上清中游离血红蛋白含量,衡量细胞破坏的程度及保存液的保护效果。筛选出试剂红细胞保存液合适的改良基础配方。并以多个组分调整为基础制作组方1、组方2、组方3,并验证多个改良组方的性能。选出性能最优的改良组方进行下一阶段实验。 根据此改良组方中添加抗氧化剂SOD,观察是否对保持效果有改善,同时以添加不同浓度的实验方式,找出添加SOD的最适浓度。并与其他同样加入SOD的配方试剂红细胞保存液进行比较,仍以邻-甲联苯胺法测定红细胞稀释保存后特定时间内上清中的游离血红蛋白含量,验证其性能。 最后用标准血型抗体血清及混合人源血清检测改良配方保存的红细胞其抗原性在保存期内的变化情况,验证新配方保存液对红细胞抗原性是否有影响,是否会导致血型血清学实验结果不正确。最终判断本次研究研制的新配方试剂用红细胞保存液性能是否优异,能否能应用于血型血清学实验室。 【结果】对比试验发现GZB保存液性能优于SAN保存液、LP保存液(P0.05)。以GZB保存液为基础改良后的组方3性能优于改良前,有效减轻红细胞破坏,与改良前比较具有显著统计学差异(P0.05)。 在保存液中添加入不同浓度的SOD,都有效的减少了红细胞的溶血现象。上清中游离的血红蛋白含量,都有了明显的下降现象。证明添加SOD能更加有效的保护红细胞。在添加不同浓度SOD时我们的实验数据显示,40000U/L至80000U/L的浓度其保护作用,最为明显。40000U/L的上清中Hb浓度与添加80000U/L时无显著差异(P0.05),将SOD最适添加浓度最终定为40000U/L。 根据保存期内对红细胞抗原性的检测,新配方保存液中红细胞抗原性所受影响比较轻微。其中A及B抗原在保存期延长至60天后,才会出现轻微的减弱,但对血型实验的结果均不会有明显的影响。 【结论】新研制的SOD-GZB试剂用红细胞保存液对试剂红细胞有很好的保护作用,保存时间可达120天。SOD-GZB保存液对红细胞抗原性无明显影响,应用于血型血清学实验中性能优异,可以应用于日常实验工作中。


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