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白术内酯的提取分离、衍生化及对PC12细胞的保护作用

王小珍  
【摘要】:白术为菊科植物白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎,味甘、苦,性温,具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎的功效,主要产于浙江、安徽、湖南、江西等地。白术内酯类化合物是白术的主要活性成分,具有抗炎、抑制肿瘤生长、调节胃肠道功能和促进营养物质吸收等多方面生理活性,因此有必要深入研究白术内酯的提取分离方法,在此基础上对其进行衍生化,考察白术内酯及其衍生物的细胞活性。 目的: 本研究以白术根茎为研究对象,探索适合白术内酯Ⅲ的制备工艺,并对分离得到的白术内酯Ⅲ进行结构修饰,得到不同的衍生物,检测白术内酯Ⅲ及其衍生物对PC12细胞的保护作用。 方法: 白术内酯的提取分离:将白术药材室温条件下用乙酸乙酯浸泡,浸提液过滤,将滤液减压蒸馏得到流浸膏,再通过多次硅胶柱层析,分离纯化得到白术内酯Ⅲ,并应用IR, UV, MS,1H-NMR及13C-NMR等现代波谱学方法对化合物结构进行鉴定。 白术内酯的结构修饰:选择合适的反应剂及催化剂对白术内酯Ⅲ进行脱水和酰化,以薄层色谱检识反应进行的情况,反应完全后选择合适的洗脱剂对反应混合物进行分离纯化,并运用上述方法测定产物的结构。 细胞活性检测:采用血清饥饿3d的方法建立PC12细胞凋亡模型,并将细胞分为对照组,模型组,加药组。在施加处理因素3d后,用MTT比色分析测定细胞吸光度值,Annexin V/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率,检测白术内酯Ⅲ及其衍生物对PC12细胞活性的影响。 结果: 本文采用乙酸乙酯室温浸泡白术饮片,结合硅胶柱层析分离纯化得到的单体化合物,外观性状,溶解性都与文献报道相符,经紫外,红外,质谱,核磁共振氢谱和碳谱鉴定,都证明为白术内酯Ⅲ,收率达到0.06%。 白术内酯Ⅲ在加入浓硫酸和乙酸酐的条件下,脱水后生成化合物L1,以毗啶为催化剂与乙酸酐反应得到乙酰化衍生物L2,并用IR, UV, MS,1H-NMR及13C-NMR做结构鉴定。 MTT比色分析测定结果显示,含白术内酯Ⅲ和L1的加药组与模型组相比吸光度均增大,而含化合物L2的加药组吸光度没有明显变化。而流式细胞术结果亦显示含白术内酯Ⅲ及化合物L1的加药组PC12细胞凋亡率下降,而化合物L2则无明显活性。 结论: 本文所建立的方法无需粉碎过筛,室温浸泡,不用加热,溶剂消耗量小,分离纯化得到的白术内酯Ⅲ纯度高,工艺简单,操作方便,成本低,适用于较大规模提取分离。 在加入浓硫酸和乙酸酐的条件下,白术内酯Ⅲ脱水后生成白术内酯Ⅱ,转化率可在90%以上,且反应较快,但加入浓硫酸的量要严格控制,且要及时摇匀,否则容易导致样品碳化,制备白术内酯Ⅲ的酰化衍生物时,乙酰化衍生物的制备较容易,以吡啶为催化剂与乙酸酐反应得到乙酰化的衍生物,反应容易进行,且产率较高,达95%以上,反应在室温下进行即可,但是需加入过量乙酸酐。 本实验MTT法与流式细胞术发现,白术内酯Ⅲ和化合物L1能够提高PC12细胞活性,降低PC12细胞凋亡发生率,而化合物L2则无明显活性,这种差异可能与分子内的-OH结构有关。


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