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川芎嗪抗缺血再灌注损伤作用与JNK信号通路的相关性分析

王昀  
【摘要】:研究脑缺血/再灌注损伤的机制及防治措施,一直是生命科学研究的重点和热点,具有重要的医学价值。而大量研究表明,脑缺血损伤与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径密切相关。而C-Jun氨基端激酶(JNK)为MAPK家族中的重要成员,已证实JNK传导通路是导致细胞凋亡的重要信号通路。它在细胞分化、凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着重要的作用。 临床中川芎嗪常用于缺血性脑血管疾病及其后遗症的治疗,然而,我们对其作用机制尚有不少争议。本研究拟在体外原代培养大鼠海马神经元细胞的基础上,探讨川芎嗪对缺氧/复氧大鼠海马神经元JNK信号通路的影响,试图通过本研究,从细胞、分子水平上阐明JNK信号通路在神经细胞凋亡中的作用,以及川芎嗪脑保护作用机制,为临床上防治缺血缺氧性疾病提供有效手段和理论依据。 1.观察JNK信号转导通路在缺血再灌注诱导体外培养的神经细胞凋亡中作用,并探讨其作用机制。 2.观察川芎嗪对缺氧/复氧大鼠海马神经元JNK信号转导通路的干预,并探讨其作用机理。 方法: 1.体外培养大鼠海马神经元,培养第7-9天,用光学显微镜观察其形态。 2.实验分组及缺氧/复氧模型的建立以培养7-9天的胎鼠海马神经元为研究对象,随机分为6组:L组(TMP低浓度组60ug/ml), M组(TMP中浓度组200ug/ml), H组(TMP高浓度组800ug/ml), C组(对照组Oug/ml), J组(JNK抑制剂组10μmol/L), N组(正常组)。除正常组外分别加入相应浓度的川芎嗪或JNK抑制剂,作用1小时后放入90%N2+10%CO2培养箱中作用2小时诱导缺氧,然后放入5%CO2培养箱中复氧。 3.培养7-9天的胎鼠海马神经元缺氧/复氧损伤后,MTT法检测细胞活力,硝酸还原酶法检测培养基上清液中NO的含量,免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白JIP-1、Bad、Caspases-1的表达。 成果: 1.缺氧/复氧损伤后,川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药组和JNK抑制剂SP60012510μmol/L组的细胞活力分别为(0.572±0.065、0.725±0.062、0.592±0.061、0.615±0.062),与单纯缺氧/复氧有显著性差异(P0.01)。川芎嗪200μg/ml组较60μg/ml、800μg/ml组差异亦有显著性。 2.缺氧/复氧损伤后,川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药组和JNK抑制剂SP60012510μmol/L组的NO含量分别为(0.057±0.013、0.053±0.018、0.044±0.006、0.047±0.009),与单纯缺氧/复氧存在差异(P0.05)。川芎嗪800μg/ml组较60μg/ml、200μg/ml组差异亦有显著性。 3.与单纯缺氧/复氧组比较,川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml组和JNK抑制剂SP60012510μmol/L组预给药均可降低JIP-1、Bad、Caspases-1蛋白的表达(P0.01)。川芎嗪200μg/ml组差异最为显著。 结论: 1.蛋白JIP-1、Bad. Caspases-1参与JNK信号转导通路介导的缺氧复氧海马神经元的损伤,JNK抑制剂SP600125能降低此效应。同时,NO很可能也参与JNK信号转导通路。 2.川芎嗪通过JNK信号转导途径,下调Caspases-1、JIP-1以及Bad蛋白的表达,下调早期NO的产生,提高神经元存活率,对大鼠海马神经元缺氧复氧损伤产生抑制作用。 3.川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度影响缺氧/复氧诱导海马神经细胞JNK信号转导通路。该作用具有剂量相关性,高、中、低三种浓度的川芎嗪均有作用,200μg/ml浓度的川芎嗪作用最显著。


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