收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

黄芩苷对NADPH氧化酶介导的炎症反应的影响

黄暨生  
【摘要】:1研究目的 动脉粥样硬化(AS)是当今引起人类死亡的头号杀手——各种心脑血管疾病的病理基础,对AS发病机制及预防治疗的研究一直是医学领域的一个重要研究课题。1999年Ross明确提出“AS是一种炎症性疾病”的概念,指出AS是一种炎症性疾病而不是单纯由于脂质沉积所致,是各种损伤通过许多细胞因子的释放诱发的一种慢性炎症,并且慢性炎症介导其发生、发展的全过程。近年来,革兰阴性菌感染及其细胞壁重要成分脂多糖(LPS)与AS形成的关系成为研究的热点。巨噬细胞在AS发生、发展中有重要作用,研究发现巨噬细胞活化后释放钙结合蛋白钙结合蛋白(S100)A8/A9复合物(S100A8/A9)激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)介导的炎症反应与AS等炎症性疾病的发生发展有关。因此通过抑制巨噬细胞NOX介导的炎症反应可以成为预防、治疗AS的一个方向。本课题组在前期研究基础上,进一步探讨黄芩苷抗AS的作用机制。本研究旨在探讨:(1)黄芩苷及LPS对巨噬细胞S100A8/A9生成的影响;(2)黄芩苷及LPS对巨噬细胞NOX基因表达的影响。 2研究方法 本研究主要通过体外实验,包括以下内容: 2.1小鼠巨噬细胞株RAW264.7的培养 将RAW264.7细胞接种到25cm2培养瓶,用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μ g/mL链霉素),在体积分数为5%CO2,37℃培养箱内培养,当细胞长至80%融合时,用0.25%含胰蛋白酶-EDTA进行消化,传代。 2.2黄芩苷对RAW264.7细胞增殖的影响 取生长对数期的RAW264.7细胞以5×104/mL浓度接种于96孔细胞培养板,每孔100μ L,待细胞长成单层铺满孔底,加入药物进行刺激。分别加入100μ L含不同浓度黄芩苷的培养基(终浓度分别为10、20、40、80、160、320、640、1280μ g/mL)为黄芩苷组,并设立不加任何刺激的正常细胞组及空白组(用无菌PBS填充),每组设8个复孔。在体积分数5%CO2,37℃培养箱内分别培养24、48、72、96h(每24h更换新鲜培养基),采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法在酶标仪波长490nm处测量各孔RAW264.7细胞吸光度(OD)值。 2.3黄芩苷对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子S100A8/A9生成的影响 取生长状态良好的RAW264.7细胞用0.25%含胰蛋白酶-EDTA消化,台盼蓝染色鉴定细胞活率≥95%,用培养基调整细胞浓度为1×106/mL,每孔1mL接种到12孔细胞培养板内,待细胞生长至80%融合时,加入刺激进行培养。 2.3.1LPS对RAW264.7细胞炎症因子S100A8/A9生成的影响 分别加入不同浓度含LPS的培养基(终浓度分别为0.1、1、10μ g/mL)进行刺激,并设立不加任何刺激的正常细胞组,每组设8个复孔。在体积分数5%CO2,37℃培养箱内分别培养4、8、12、16、20、24h后,收集各组细胞培养上层清液,采用酶联免疫吸附法(ELISA),用S100A8/A9ELISA试剂盒检测上层清液中炎症因子的含量。在酶标仪波长450nm处测量各孔的OD值。 2.3.2黄芩苷对RAW264.7细胞S100A8/A9生成的影响 实验分组如下:正常细胞组、模型组、黄芩苷组、黄芩苷加LPS组。加入含LPS的培养基(终浓度为1μ g/mL)为模型组,分别加入不同浓度含黄芩苷的培养基(终浓度为10、50、100μ g/mL)预处理1h为黄芩苷组,再加入LPS(终浓度为1μ g/mL)为黄芩苷加LPS组,并设立不加任何刺激的正常细胞组,每组设8个复孔。在体积分数5%CO2,37℃培养箱内培养12h后,收集各组细胞培养上层清液,采用ELISA法,用S100A8/A9ELISA试剂盒检测上层清液中炎症因子的含量。在酶标仪波长450nm处测量各孔的OD值。 2.4黄芩苷对LPS诱导的NOX gp91phox亚基(NOX2)mRNA表达的影响 取生长对数期的细胞以1×106/mL的浓度接种于12孔细胞培养板内,待细胞生长至80%融合时,加入刺激进行培养。 2.4.1LPS对RAW264.7细胞NOX2mRNA表达的影响 分别加入不同浓度含LPS的培养基(终浓度分别为0.1、1、10μ g/mL)进行刺激,并设立不加任何刺激的正常细胞组,每组设4个复孔。在体积分数5%CO2,37℃培养箱内分别培养4、8、12、16、20、24h后,用Trizol法提取细胞总RNA。 2.4.2黄芩苷对RAW264.7细胞NOX2mRNA表达的影响 实验分组如下:正常细胞组、模型组、黄芩苷组、黄芩苷加LPS组。加入含LPS的培养基(终浓度为1μ g/mL)为模型组,分别加入不同浓度含黄芩苷的培养基(终浓度为10、50、100μ g/mL)预处理1h为黄芩苷组,再加入LPS(终浓度为1μ g/mL)为黄芩苷加LPS组,并设立不加任何刺激的正常细胞组,每组设4个复孔。在体积分数5%C02,37℃培养箱内培养12h后,用Trizol法提取细胞总RNA。 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NOX2mRNA的表达。逆转录以总RNA为模板,以Oligo dT-Adaptor为引物逆转录合成第一链cDNA; PCR用特异性引物分别扩增目标基因NOX2和内参基因GAPDH。见表1。 PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,电泳条带采用Quantity One软件分析目标基因NOX2与内参基因GAPDH的PCR产物灰度值,以目标基因与内参基因灰度比值来表示目标基因mRNA的相对表达量。 3研究结果 3.1小鼠巨噬细胞株RAW264.7的培养 在倒置显微镜下观察到RAW264.7为贴壁细胞,形状呈圆形或不规则形,有伪足,呈“铺路石”样紧密镶嵌排列。 3.2黄芩苷对RAW264.7细胞增殖的影响 黄芩苷对RAW264.7细胞增殖的影响,对黄芩苷刺激浓度、时间依赖关系。计算得到24、48、72、96h半数抑制浓度(ICSO)分别为1057.772、475.265、223.522、132.054μ g/mL,了解黄芩苷的毒性为选择安全剂量提供依据,本研究选择黄芩苷刺激浓度和时间在1057.772μ g/mL以下,24h以内。 对黄芩苷刺激时间、浓度和OD值进行多重线性回归分析,多重线性回归的方程表达式:y=1.083-0.050x-0.064x2。y为OD值,x1为黄芩苷刺激时间,x2为黄芩苷刺激浓度,可见黄芩苷刺激时间、浓度和OD值呈显著负相关(P0.05)。 3.3黄芩苷对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子S100A8/A9生成的影响 3.3.1LPS对RAW264.7细胞S100A8/A9生成的影响 在正常情况下RAW264.7细胞培养上清中S100A8/A9含量不高,LPS刺激与正常细胞组比较可以促进RAW264.7细胞S100A8/A9的生成(P0.05),并且存在对LPS刺激浓度、时间依赖关系。S100A8/A9的生成在LPS刺激浓度为1μ g/mL,刺激时间为12h达到峰值,因此选择1μ g/mL、12h作为LPS刺激浓度和时间。 对LPS刺激时间、浓度和S100A8/A9含量进行多重线性回归分析,多重线性回归的方程表达式:y=587.399+132.183x1+1068.888x2。y为S100A8/A9含量,x2为LPS刺激时间,x2为LPS刺激浓度,可见LPS刺激时间、浓度和S100A8/A9含量呈显著正相关(P0.05)。 3.3.2黄芩苷对RAW264.7细胞S100A8/A9生成的影响 黄芩苷(10、50、100μ g/mL)单独与正常细胞组比较对RAW264.7细胞S100A8/A9的作用无明显影响(P0.05)。LPS(1μ g/mL)刺激与正常细胞组比较可以显著促进RAW264.7细胞S100A8/A9合成(P0.001)。在10-100μ g/mL浓度范围内,黄芩苷预处理均能有效抑制LPS诱导的S100A8/A9的生成,并且存在药物浓度依赖性,与模型组比较有统计学显著性差异(P0.05、0.001)。 3.4黄芩苷对LPS诱导的NOX2mRNA表达的影响 3.4.1LPS对RAW264.7细胞NOX2mRNA表达的影响 RAW264.7细胞NOX2基因在正常情况下表达极低。加LPS刺激后与正常细胞组进行比较,RAW264.7细胞NOX2基因表达上调(P0.05),并且存在对LPS刺激浓度、时间依赖关系。NOX2基因表达在LPS刺激浓度为1μ g/mL,刺激时间为12h达到峰值,因此选择1μ g/mL、12h作为LPS刺激浓度和时间。 对LPS刺激时间、浓度和NOX2mRNA相对表达量进行多重线性回归分析,多重线性回归的方程表达式:y=0.226+0.019x1+0.177x2。y为NOX2mRNA相对表达量,x1为LPS刺激时间,x2为LPS刺激浓度,可见LPS刺激时间、浓度和NOX2mRNA相对表达量呈正相关,且LPS刺激浓度有统计学差异显著性(P0.05)。 3.4.2黄芩苷对RAW264.7细胞NOX2mRNA表达的影响 单独加入黄芩苷(10、50、100μ g/mL)对RAW264.7细胞NOX2基因表达也没有影响(P0.05)。LPS(1μ g/mL)刺激与正常对照组比较可以显著促进RAW264.7细胞NOX2基因表达(P0.001)。在10-100μ g/mL浓度范围内,黄芩苷预处理均能有效抑制LPS诱导的NOX2基因的表达,并且存在药物浓度依赖性,与模型组比较有统计学显著性差异(P0.001)。 4实验结论 巨噬细胞的增殖对黄芩苷刺激浓度、时间依赖关系,并表现出多重线性负相关。计算得到24、48、72、96h半数抑制浓度(ICSO)分别为1057.772、475.265、223.522、132.054μ g/mL,了解黄芩苷的毒性为选择安全剂量提供依据。本研究选择黄芩苷刺激浓度和时间在1057.772μ g/mL以下,24h以内。 LPS刺激可以诱导巨噬细胞活化,促进细胞因子S100A8/A9的生成以及上调NOX2基因表达,并和LPS刺激剂量和刺激时间表现出多重线性正相关,同时黄芩苷预处理能显著抑制LPS刺激引起的巨噬细胞大量生成的细胞因子S100A8/A9,降低了NOX2基因的表达,并且存在药物浓度依赖性。 实验结果表明黄芩苷能通过抑制巨噬细胞的增殖,抑制细胞因子S100A8/A9的过度表达,降低NOX2基因的表达从而抑制炎症反应,从抗炎角度初步明确了黄芩苷抗AS的作用机制,为黄芩苷的应用提供了理论基础。 本研究从体外实验,探讨了黄芩苷在细胞增殖、基因调节以及炎症因子几个方面抑制AS的作用与机制。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 万春艳;林玉庆;;黄芩苷药剂中pH稳定性的研究[J];黑龙江医药;2007年03期
2 张家康,刘会前;不同厂家银黄口服液中黄芩苷含量考察[J];中国医院药学杂志;1996年10期
3 程智勇,韩凤梅,蔡敏,陈勇;HPCE法测定双黄连口服液中的黄芩苷和绿原酸[J];药学学报;1999年11期
4 金蜀蓉;鼻炎康滴鼻液中黄芩苷的含量测定[J];中国药房;2001年02期
5 张艺,王祥培;薄层扫描法测定甘露饮中黄芩苷的含量[J];中国现代应用药学;2002年01期
6 贾善学,李锦绣,赵卫,张军华;反相高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[J];中国新药杂志;2002年10期
7 李欣 ,吴毅;HPLC法测定小柴胡颗粒剂中黄芩苷的含量[J];广西医学;2002年04期
8 黄淑彰,熊佐章;紫外分光光度法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[J];基层中药杂志;2002年01期
9 宋红英,刘放;反相高效液相色谱法测定黄芩及其制剂中黄芩苷含量[J];药学实践杂志;2002年05期
10 茹波,王志刚,樊东练;高效液相色谱法测定清开灵喷雾剂中黄芩苷的含量[J];辽宁药物与临床;2003年04期
11 蔡为群,顾雪中;高效液相色谱法测定三黄片中黄芩苷的含量[J];时珍国医国药;2003年03期
12 管英,李永冥;不同类型基质的黄芩苷软膏透皮吸收的研究[J];中国药业;2003年01期
13 张俐,王玉,王强;HPLC测定清脑降压颗粒中黄芩苷的含量[J];中成药;2004年05期
14 王栋;麻世泽;隋丽华;郭珉;韩国柱;李楠;;RP-HPLC法测定痒疹颗粒中芍药苷和黄芩苷[J];中草药;2005年11期
15 贾艳萍;张春玲;鞠振国;王艳慧;;微波辅助提取黄芩苷[J];食品与生物技术学报;2008年03期
16 郭温迎;庄建芳;;HPLC法测定银黄颗粒中黄芩苷的含量[J];中国中医药科技;2010年05期
17 刘起中,邱少华,张家国;HPLC法测定清喉咽合剂中黄芩苷的含量[J];山东医药工业;2000年06期
18 谢东,路玫;薄层扫描法测定抗毒利咽口服液中黄芩苷的含量[J];西北药学杂志;2000年04期
19 郭振库,金钦汉,范国强,段豫平,秦晨;黄芩中黄芩苷微波提取的实验研究[J];中草药;2001年11期
20 孙立新,赵挺;高效液相色谱法测定小儿清肺颗粒中黄芩苷的含量[J];中国中药杂志;2001年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 林秉奖;闵玮;骆丹;;黄芩苷防护中波紫外线损伤HaCaT细胞的蛋白质组学研究[A];2010全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2010年
2 梁清华;曾光;游万辉;吴汉军;;黄芩苷对T淋巴细胞增殖与活化的影响[A];全国第八届中西医结合风湿病学术会议论文汇编[C];2010年
3 耿淼;陈红艳;王建华;;黄芩苷对Aβ25-35诱导SH-SY5Y凋亡的保护作用及机制研究[A];第十届全国抗炎免疫药理学学术会议论文集[C];2010年
4 李兴泰;陈瑞;;黄芩苷对活性氧引起鼠脑线粒体损伤的保护作用[A];全国中药研究与开发学术研讨会论文摘要集[C];2001年
5 吴迪;骆丹;闵玮;林秉奖;;黄芩苷抑制UVA所致人成纤维细胞光老化的研究[A];2010全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2010年
6 魏清;;高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[A];2011年全国医药学术论坛交流会暨临床药学与药学服务研究进展培训班论文集[C];2011年
7 李静;王志举;朱慧英;;黄芩苷对大鼠离体气管平滑肌的舒张作用及其机制的研究[A];中南地区第八届生理学学术大会论文摘要汇编[C];2012年
8 罗丽萍;刘刚;;鼻炎冲剂的制备及质量标准研究[A];中华中医药学会中成药学术研讨会论文集[C];2007年
9 徐晓英;安睿;王新宏;张国明;;黄芩的调节性提取工艺研究[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年
10 彭柳;康红英;杨青;;HPLC法测定黄连上清丸中黄芩苷的含量[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邱家章;黄芩苷抗金黄色葡萄球菌α-溶血素作用靶位的确证[D];吉林大学;2012年
2 黄永建;黄芩苷对小鼠巨细胞病毒肝炎的治疗作用及其机制研究[D];华中科技大学;2011年
3 周庆博;黄芩苷对实验性大鼠脑出血神经保护作用的研究[D];山东大学;2011年
4 唐美林;黄芩苷促进小鼠胚胎干细胞向功能性心肌细胞分化及其调控机制[D];华中科技大学;2012年
5 董丽华;SM22α和黄芩苷抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成的分子机制[D];河北医科大学;2010年
6 乔洪翔;黄芩苷的二次开发研究及含马兜铃酸中药材安全性评价示范研究[D];浙江大学;2010年
7 刘养凤;黄芩苷抗癫痫发生及神经保护的实验研究[D];第四军医大学;2012年
8 周炳荣;黄芩苷干预UVB辐射后皮肤光损伤及microRNA表达谱的实验研究[D];南京医科大学;2009年
9 张群;拟南芥磷脂酶D和磷脂酸对微管形态和NADPH氧化酶活性调控机制的研究[D];南京农业大学;2009年
10 林凡;玉米(Zea mays L.)NADPH氧化酶基因克隆、表达特性及功能研究[D];南京农业大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄暨生;黄芩苷对NADPH氧化酶介导的炎症反应的影响[D];广州中医药大学;2012年
2 袁京群;银黄口服液的药代动力学研究[D];浙江大学;2004年
3 张涛;黄芩苷对2型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡及survivin表达的影响[D];兰州大学;2010年
4 郭少英;黄芩苷对脑缺血的治疗作用及抗氧化机制研究[D];北京中医药大学;2011年
5 李倩楠;黄芩苷的解热作用与内生致热原的关系[D];扬州大学;2009年
6 刘莉;小儿退热按摩乳的研究[D];山东中医药大学;2003年
7 任振兴;黄芩愈伤组织培养及其次级代谢物合成调控的研究[D];山西大学;2006年
8 许方美;黄芩苷单克隆抗体的制备及其应用[D];厦门大学;2009年
9 赵永旺;乳腺炎发病机制及黄芩苷治疗作用研究[D];河北农业大学;2006年
10 李海燕;柴芩胰康胶囊的研究[D];吉林大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王超云;黄芩苷对脑损伤有保护作用[N];中国医药报;2004年
2 冯友根;黄芩苷对缺血心肌的保护作用[N];中国医药报;2003年
3 程书权;黄芩的药理作用[N];中国中医药报;2002年
4 徐丽荣;马世彬;李澎涛;唐启盛;清开灵于细胞黏附环节发挥作用[N];中国医药报;2004年
5 沈群 罗佳波;重视中药复方药动学研究的特殊性[N];中国医药报;2005年
6 杨家惠;生产企业偷换药品标签的两种情形及处罚依据[N];中国医药报;2003年
7 刘 斌;黄酮类化合物——中药化学(十五)[N];中国中医药报;2004年
8 陈玉婷;中药鉴定[N];中国中医药报;2003年
9 ;二氢吡啶对雏鸡免疫功能的影响[N];中国畜牧水产报;2001年
10 吕方;光合作用[N];大众科技报;2002年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978