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溃结灵对NF-кB活化的IκBα磷酸化/泛素化的作用机制研究

唐立海  
【摘要】:目的: NF-κB信号传导途径的激活与否关系到溃疡性结肠炎的发生、发展及转归。NF-κB信号途径的开放与激活是UC发病的关键环节,并形成以NF-κB为中心,以细胞因子、趋化因子、黏附分子、异常免疫反应等为网络的相互制约、相互影响的发病机制。鉴于NF-κB在疾病发生发展中的重要作用,调节NF-κB激活的每个环节都可能成为药物干预的靶点,但由于各条通路均是通过激活IKK而最终激活NF-κB,所以IKK/IΚB/NF-κB激活通路成为药物干预的理想靶点,也是当前药物研究的一个热点。因此研究IκBα、IKKβ泛素蛋白酶体系统在UC发生发展及修复过程中的变化及中药的干预作用,对探讨中药治疗UC的疗效机制有重要理论意义。 前期研究表明,溃结灵对异种抗原免疫模型、二硝基氯苯模型、三硝基苯磺酸模型等三种溃疡性结肠炎大鼠模型均有较好的治疗作用,能降低结肠溃疡点数,减轻炎性细胞浸润,同时降低TNBS法UC大鼠模型结肠黏膜中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量,使NF-κB相对活性明显降低,下调NF-κB p65蛋白表达。为进一步探讨其对NF-κB活化抑制的深层次作用机理,本研究在前期研究基础上进一步从细胞因子表达源头NF-κB活化及其调控入手,采用TNBS复制UC大鼠模型及TNF-α诱导Caco-2细胞炎症模型,从整体和细胞水平观察溃结灵对IκBα、IKKβ,泛素系统相关分子E1、E2、E3的mRNA及蛋白表达水平的影响,探讨溃结灵抑制NF-κB活化的IκB磷酸化及泛素化机制,揭示溃结灵治疗UC的深层次作用机理。 内容: 1.溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜IκBα IKKβ mRNA与蛋白表达的影响 几乎所有已知NF-κB诱导物均能通过IκBα的降解,迅速而短暂地活化NF-κB IκBα降解的起始环节磷酸化是在活化的IKK复合物催化作用下完成的。本实验通过观察溃结灵对UC大鼠模型结肠黏膜IκBα、IKKβmRNA和蛋白表达以及pIκBα蛋白表达的影响,并探讨相关作用机制。 方法:TNBS法复制UC大鼠模型,随机分为UC模型对照组,阳性药对照组,溃结灵高、中、低剂量组,同时设空白对照组。药物治疗结束后,刮取结肠黏膜。采用实时定量PCR法测定IκBα和IKKβ的mRNA表达,以及Western blot法检测IκBα、pIκBα和IKKβ的蛋白表达。 结果:模型组大鼠结肠黏膜组织IκBα mRNA表达量明显低于正常组(P0.01),溃结灵高剂量组IκBα mRNA表达量明显高于模型组(P0.05);模型组IKKβ mRNA表达量高于正常组,但无统计学意义(P0.05),溃结灵高、中、低剂量组IKKβ mRNA表达量明显低于模型组(P0.05);模型组大鼠结肠黏膜组织IκBα蛋白相对表达量明显低于正常组(P0.05),溃结灵高、中剂量组IκBα蛋白相对表达量均明显高于模型组(P0.01,P0.05);模型组大鼠结肠黏膜组织pIκBα蛋白相对表达量显著高于正常组(P0.01),溃结灵高、低剂量组pIκBα蛋白相对表达量均明显低于模型组(P0.01,P0.05);模型组IKK β蛋白相对表达量显著高于正常组(P0.01),溃结灵高、中剂量组IKK β蛋白相对表达量均明显低于模型组(P0.05)。 2.溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜E1.UBC5.E3RSIKBmRNA与蛋白表达的影响 磷酸化的IKB(pIKB)被泛素系统连接酶复合物识别,将泛素蛋白分子逐个顺次加到IKB分子上,IKB的多聚泛素化使其获得了一种“死亡标记”,从而被细胞内专门降解蛋白质的26S蛋白酶体识别并降解,NF-κB获得自由并迅速易位至核内与相应基因的顺式作用元件特异性结合,调节基因的表达。为探讨泛素蛋白酶体系统相关酶的表达是否与IκBα的降解相关,因此本实验在实验一的研究基础上,观察溃结灵对UC大鼠模型结肠黏膜E1、UBC5.E3RSIKB mRNA及蛋白表达的影响,从泛素化角度探讨其抑制NF-κB活化的相关作用机制。 方法:造模、分组、给药,取材同实验一。采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测结肠黏膜El. UBC5和E3RSIκB mRNA表达,Eli sa方法检测结肠黏膜E1、UBC5和E3RSIKB蛋白含量。 结果:TNBS法UC模型大鼠结肠黏膜组织E1、UBC5mRNA相对表达量与正常组相比,均无统计学意义(P0.05),溃结灵各剂量组E1、UBC5mRNA相对表达量与模型组相比,亦无统计学意义(P0.05); TNBS法UC模型大鼠结肠黏膜组织E3RSIκB mRNA(?)目对表达量明显高于正常组(P0.05),溃结灵高剂量组E3RSIκB mRNA相对表达量明显低于模型组(P0.05); TNBS法UC模型大鼠结肠黏膜组织E1. UBC5蛋白相对表达量与正常组相比,均无统计学意义(P0.05),溃结灵各剂量组E1蛋白相对表达量与模型组相比,无统计学意义(P0.05),溃结灵高剂量组UBC5蛋白相对表达量明显低于模型组(P0.05);TNBS法UC模型大鼠结肠黏膜组织E3RSIκB蛋白相对表达量明显高于正常组(P0.05),溃结灵高、低剂量组E3RSIκB蛋白相对表达量明显低于模型组(P0.01,P0.05)。 3.溃结灵对TNF-α诱导的Caco-2细胞NF-κB p65DNA结合活性的影响 本实验在前期的研究基础上,将人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞体外含药血清共培养,用TNF-α作为刺激因子,硼替佐米作为泛素蛋白酶体通路阻断剂对照,检测Caco-2细胞中NF-κB p65蛋白DNA结合活性,旨在从细胞信号角度探讨溃结灵在TNF-α诱导Caco-2细胞NF-κB通路中的作用,为进一步阐明UC发生机制及其防治提供理论和实验依据。 方法:将生长密度为70-80%左右的Caco-2细胞分成七个组:空白组、模型组、蛋白酶抑制剂硼替佐米组、阳性药组(SASP)、溃结灵高、中、低剂量组;TNF-α刺激细胞建立炎症细胞模型,收集细胞标本提取核蛋白,采用以ELISA为基础的Trans AMTM NF-κB p65试剂盒检测细胞核蛋白NF-κB p65的DNA结合活性。 结果:TNF-α刺激的模型组细胞NF-κB p65相对活性明显高于正常组(P0.01),溃结灵高、中剂量组细胞NF-κB p65相对活性均明显低于模型组(P0.01)。4.溃结灵对TNF-α诱导的Caco-2细胞IκBα、IKKβ mRNA与蛋白表达的影响 整体动物实验结果表明,溃结灵对TNBS法UC大鼠模型肠黏膜IκBα的mRNA和蛋白表达有上调作用,对IKKβ mRNA和蛋白及pIκBα蛋白的表达有下调作用。为进一步确定溃结灵对IκBα磷酸化机制的作用,本实验在细胞实验上,观察溃结灵对TNF-α刺激的Caco-2细胞中IKKβ及IκBα、pIκBα表达的影响,探讨其抑制NF-κB活化的作用机制。 方法:细胞培养、分组、给药、收集细胞样本同实验三。采用实时定量荧光PCR方法检测Caco-2细胞IκBα、IKKβmRNA表达,Western blot方法检测Caco-2细胞IκBα、 pIκBα和IKKβ蛋白相对表达量。 结果:TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组IκBα mRNA表达明显低于正常组(P0.05),溃结灵高剂量组IκBα mRNA表达明显高于模型组(P0.05); TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组IKKβ mRNA表达明显高于正常组(P0.05),溃结灵高剂量组IKKβ mRNA表达明显低于模型组(P0.05); TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组IκBα蛋白表达明显低于正常组(P0.05),溃结灵高、中剂量组IκBα蛋白表达明显高于模型组(P0.05); TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组pIκBα蛋白表达明显高于正常组(P0.05),溃结灵高、低剂量组pIκBα蛋白表达明显低于模型组(P0.05); TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组IKKβ蛋白表达明显高于正常组(P0.05),溃结灵高、中剂量组IKKβ蛋白表达明显低于模型组(P0.05)。 5.溃结灵对TNF-α诱导的Caco-2细胞E1、UBC5、E3RSIκB mRNA与蛋白表达的影响 前面细胞实验结果显示,TNF-α刺激的Caco-2细胞中,IκBα的mRNA(?)口蛋白表达明显降低,而NF-κB p65蛋白DNA结合活性明显升高,且在蛋白酶体抑制剂组中,IκBα表达明显升高,NF-κB的活性得到抑制,表明泛素蛋白酶体系统在IκBα的降解和NF-κB的活化中有重要作用。为此,本实验在整体动物实验研究基础上,从细胞信号角度探讨UPP在TNF-α刺激Caco-2细胞的NF-κB信号通路中的作用,为进一步阐明UC发生机制及其防治提供理论和实验依据,并且探讨溃结灵对NF-κB活化抑制的相关作用机制。 方法:细胞培养、分组、给药、收集细胞样本同实验三。采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法检钡Caco-2细胞E1、UBC5和E3RSIκB mRNA表达,Elisa方法检测Caco-2细胞E1、UBC5和E3RSIκB蛋白含量。 结果:TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组E1、UBC5mRNA相对表达量与正常组相比,均无统计学意义(P0.05),溃结灵各剂量组E1、UBC5mRNA相对表达量与模型组相比,亦无统计学意义(P0.05); TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组E3RSIκB mRNA相对表达量明显高于正常组(P0.05),溃结灵高、中剂量组E3RSIKB mRNA相对表达量明显低于模型组(P0.01,P0.05);TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组E、UBC5蛋白含量与正常组相比,均无统计学意义(P0.05),溃结灵各剂量组E1蛋白含量与模型组相比,无统计学意义(P0.05),溃结灵中剂量组UBC5蛋白含量明显低于模型组(P0.05);TNF-α诱导的Caco-2细胞模型组E3RSIKB蛋白含量明显高于正常组(P0.05),溃结灵高、中剂量组E3RSIKB蛋白含量明显低于模型组(P0.05)。 结论: 综合研究结果分析,UC模型大鼠的结肠黏膜IκBα mRNA与蛋白表达明显下降,IKKβ蛋白与pIκBα蛋白、E3RSIκB mRNA和蛋白表达明显上升;TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型中,NF-κB p65DNA结合活性、IKKβ mRNA和蛋白、pIκBα蛋白、E3RSIκB mRNA和蛋白表达明显上升,IκBα mRNA与蛋白表达明显下降,与整体动物实验结果一致。提示UC发病时,IKKβ和E3RSIKB的活性升高,分别催化IκBα发生磷酸化及泛素化降解,随着IκBα的降解,NF-κB通路处于激活状态;NF-κB的活性升高,与多种细胞基因的启动子或增强子中的KB序列位点特异结合而促进转录和表达,导致机体炎症因子失衡及炎性细胞浸润的发生。通过溃结灵治疗后,整体动物和细胞实验显示:IκBα表达有明显的上调,而且IKKβ、E3RSIκB、pIκBα表达有明显的下调,且在细胞实验中,NF-κB p65DNA结合活性明显受到抑制,这与蛋白酶体抑制剂硼替佐米组作用相似。 本论文通过观察溃结灵对TNBS法UC模型大鼠结肠黏膜及TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型IKBα、pIκBα、IKKβ、E3RSIKB等表达的影响,得出如下结论:1.TNF-α可能通过泛素蛋白酶体途径降解IκBα蛋白,从而导致NF-κB p65DNA结合活性升高;2.E3蛋白连接酶E3RSIκB可能参与了TNF-α诱导的Caco-2细胞IκBα的泛素化降解;3.溃结灵可通过抑制IKKβ、E3RSIKB的活性阻止IκBα磷酸化及泛素化从而间接抑制NF-κB信号通路激活,影响UC的发生,发展及转归,这可能是溃结灵抑制NF-κB过度活化的作用靶点,这在一定程度上也体现了中医药多靶点,多层次的作用特点。


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